Miễn dịch huỳnh quang và Định vị protein

Miễn dịch huỳnh quang sử dụng các kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang để tìm các phân tử cụ thể trong tế bào và mô, nhờ đó một protein hoặc kháng nguyên mục tiêu sẽ phát sáng ở bất cứ nơi nào nó được định vị. Phương pháp này kết hợp tính đặc hiệu của liên kết kháng thể với độ tương phản của kính hiển vi huỳnh quang và là một phương pháp chính để lập bản đồ vị trí của protein trong tế bào.

Definition

Miễn dịch huỳnh quang (kỹ thuật kháng thể huỳnh quang) là một phương pháp trong đó các kháng thể liên hợp với các chất phát huỳnh quang liên kết với một kháng nguyên mục tiêu để vị trí của nó trong một tế bào hoặc mô có thể được hình dung bằng kính hiển vi huỳnh quang; định vị protein là việc xác định vị trí của một protein nhất định trong tế bào.

Scope

Mục này bao gồm nguyên lý của việc gắn nhãn huỳnh quang dựa trên kháng thể, các sơ đồ phát hiện trực tiếp và gián tiếp, và việc sử dụng phương pháp này để định vị protein vào các ngăn tế bào. Nó coi miễn dịch huỳnh quang là một phương pháp định vị trong hình ảnh tế bào chứ không phải là hướng dẫn lâm sàng.

Core questions

• Làm thế nào một kháng thể mang lại tính đặc hiệu phân tử cho một tín hiệu huỳnh quang?
• Điều gì phân biệt miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với gián tiếp?
• Làm thế nào một protein được gán cho một ngăn tế bào cụ thể?
• Những kiểm soát nào bảo vệ chống lại các tín hiệu không đặc hiệu hoặc sai?

Key concepts

• Tính đặc hiệu kháng thể-kháng nguyên
• Liên hợp chất phát huỳnh quang
• Phát hiện trực tiếp so với gián tiếp
• Đồng định vị
• Gán ngăn dưới tế bào
• Kiểm soát đặc hiệu

Mechanisms

Một kháng thể được tạo ra chống lại một kháng nguyên mục tiêu được gắn với một thuốc nhuộm huỳnh quang, như lần đầu tiên được chứng minh bởi Coons và các đồng nghiệp, để liên kết đánh dấu vị trí của kháng nguyên bằng một tín hiệu huỳnh quang có thể đọc được bằng kính hiển vi; Coons và Kaplan đã tinh chỉnh phương pháp mô để các kháng nguyên có thể được phát hiện đáng tin cậy trong tế bào. Trong miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, kháng thể được gắn nhãn liên kết trực tiếp với mục tiêu, trong khi trong miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, một kháng thể sơ cấp không gắn nhãn được phát hiện bởi một kháng thể thứ cấp được gắn nhãn, khuếch đại tín hiệu. Vị trí được đọc bằng cách xem tín hiệu rơi vào đâu so với các dấu hiệu đã biết, và bộ công cụ huỳnh quang mở rộng được Giepmans và các đồng nghiệp xem xét — bao gồm các protein huỳnh quang — mở rộng việc định vị đó sang các tế bào sống, trong khi các phương pháp siêu phân giải được Schermelleh và các đồng nghiệp khảo sát làm sắc nét nó dưới giới hạn nhiễu xạ. Các kiểm soát đặc hiệu là cần thiết để phân biệt liên kết thực sự với tín hiệu nền.

Clinical relevance

Miễn dịch huỳnh quang được sử dụng trong chẩn đoán — ví dụ trên các mẫu sinh thiết thận và da và trong việc phát hiện các tự kháng thể — và rộng rãi trong nghiên cứu để định vị protein. Mục này giải thích cách tín hiệu định vị được tạo ra và giải thích và mang tính giáo dục tham khảo, không phải là cơ sở cho các quyết định chẩn đoán hoặc điều trị cá nhân.

History

Albert Coons và các đồng nghiệp đã giới thiệu việc gắn nhãn kháng thể huỳnh quang vào khoảng năm 1941 và tinh chỉnh nó để phát hiện kháng nguyên mô vào năm 1950, đặt nền móng cho miễn dịch huỳnh quang. Sự ra đời sau này của các chất phát huỳnh quang sáng và các protein huỳnh quang được mã hóa di truyền, được liệt kê trong bộ công cụ huỳnh quang của Giepmans và các đồng nghiệp, và của hình ảnh siêu phân giải đã mở rộng đáng kể độ chính xác mà protein có thể được định vị trong tế bào.

Key figures

• Albert Coons
• Roger Tsien
• Mark Ellisman

Seminal works

• coons-1941
• coons-1950
• giepmans-2006

Frequently asked questions

Sự khác biệt giữa miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp là gì?

Trong miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, chất phát huỳnh quang được gắn vào kháng thể liên kết với mục tiêu; trong miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, một kháng thể thứ cấp được gắn nhãn phát hiện một kháng thể sơ cấp không gắn nhãn, giúp khuếch đại tín hiệu.

Miễn dịch huỳnh quang cho thấy protein nằm ở đâu trong tế bào như thế nào?

Kháng thể chỉ liên kết với kháng nguyên đặc hiệu của nó, vì vậy tín hiệu huỳnh quang xuất hiện ở bất cứ nơi nào protein đó được định vị, và vị trí của nó so với các dấu hiệu tế bào đã biết cho thấy ngăn mà nó chiếm giữ.