Floresan İn Situ Hibridizasyonu (FISH)
Floresan in situ hibridizasyonu (FISH), floresan etiketli DNA problarını kullanarak spesifik kromozomal dizilere bağlanan ve daha sonra bir floresan mikroskobu altında doğrudan kromozomlar üzerinde veya hücre çekirdeklerinde görselleştirilen moleküler bir sitogenetik tekniktir. Tüm genomu taramak yerine tanımlanmış lokusları hedefleyerek, FISH, bölünmeyen (interfaz) hücreler de dahil olmak üzere, yüksek hassasiyetle spesifik delesyonları, duplikasyonları, yeniden düzenlenmeleri ve anöploidileri tespit etmekte ve lokalize etmektedir.
Tanım
FISH, etiketli bir nükleik asit probunun, bir kromozom preparatı veya hücre çekirdeği üzerinde sabitlenmiş tamamlayıcı dizilere hibridize edildiği ve floresans ile tespit edildiği bir tekniktir; bu, spesifik genomik hedeflerin tanımlanmasına, sayılmasına veya lokalize edilmesine olanak tanımaktadır.
Kapsam
Bu konu, prob hibridizasyonunun prensibini, başlıca prob tiplerini ve kullanımlarını (lokusa-spesifik, sentromerik ve tüm-kromozom boyama probları) ve FISH'in metafaz ve interfaz hücrelerine uygulanmasını kapsamaktadır. Bu, metodolojik bir referanstır ve klinik yönetim rehberliği sağlamamaktadır.
Temel sorular
- Etiketli bir prob, kromozomal hedefine spesifik, tespit edilebilir bağlanmayı nasıl sağlamaktadır?
- Lokusa-spesifik, sentromerik ve kromozom-boyama problarını birbirinden ayıran nedir?
- FISH neden metafaz hücrelerinin yanı sıra interfaz hücrelerine de uygulanabilmektedir?
- FISH, bantlama yönteminin çözemediği hangi hedefe yönelik anormallikleri çözmektedir?
Anahtar kavramlar
- Nükleik asit hibridizasyonu
- Floresan etiketli prob
- Lokusa-spesifik prob
- Sentromerik (alfa-uydu) prob
- Tüm-kromozom boyama probu
- İnterfaz ve metafaz FISH
- Prob spesifisitesi ve sinyal sayımı
- Mikrodelesyon tespiti
Mekanizmalar
Hedef diziye tamamlayıcı bir DNA probu, bir florofor ile (doğrudan veya bir raportör molekül aracılığıyla) etiketlenmektedir. Lam üzerindeki hedef kromozomal DNA ve prob tek sarmallara denatüre edilmekte ve ardından tavlanmaya bırakılmaktadır, böylece prob, yerindeki tamamlayıcı dizisine hibridize olmaktadır. Bağlanmamış prob yıkandıktan sonra, bağlı sinyal floresan mikroskopisi ile görselleştirilmektedir. Farklı prob tasarımları farklı amaçlara hizmet etmektedir: lokusa-spesifik problar, tanımlanmış bir gen veya bölgedeki kazançları, kayıpları veya yeniden düzenlenmeleri tespit etmekte veya doğrulamaktadır; sentromerik problar, belirli bir kromozomun kopyalarını saymaktadır (anöploidi sayımı); ve tüm-kromozom boyama probları, karmaşık yeniden düzenlenmeleri karakterize etmek için tüm bir kromozomu etiketlemektedir. Hibridizasyon bölünme halindeki hücreleri gerektirmediğinden, FISH interfaz çekirdekleri üzerinde gerçekleştirilebilmekte, metafaz preparatlarının elde edilmesinin zor olduğu doku ve örneklere analizi genişletmektedir.
Klinik önem
FISH, spesifik mikrodelesyon ve mikroduplikasyon durumlarını doğrulamak veya dışlamak, anöploidileri saymak ve belirli kanserleri karakterize edenler gibi tanımlanmış yeniden düzenlenmeleri tespit etmek için kullanılmaktadır. İnterfaz hücreleri de dahil olmak üzere hedefe yönelik, yüksek hassasiyetli tespit ekleyerek karyotiplemeyi tamamlamaktadır. Bu madde, FISH bulgularının nasıl üretildiğini açıklamaktadır; bireysel tanı veya tedavi kararları için bir temel değildir.
Kanıt ve kılavuzlar
FISH bulguları, prob sinyalleri ve hibridizasyon sonuçları için notasyonu içeren İnsan Sitogenomik Nomenklatürü Uluslararası Sistemi (ISCN) içinde tanımlanmaktadır.
Tarihçe
İn situ hibridizasyon, ilk olarak 1960'ların sonlarında radyoaktif problarla geliştirilmiştir. 1986'da Pinkel, Straume ve Gray tarafından kantitatif olarak gösterilen floresan tespitine geçiş, daha hızlı, daha güvenli ve çok renkli yetenekli bir yöntem sağlamış ve moleküler sitogenetiği başlatmıştır. Sonraki prob tasarımları ve çok renkli yaklaşımlar, FISH'i tek lokus tespitinden birçok hedefin eş zamanlı analizine doğru genişletmiş, klasik sitogenetik ve moleküler genetik arasında köprü kurmuştur.
Öne çıkan isimler
- Daniel Pinkel
- Joe W. Gray
- Michael Speicher
- Nigel Carter
İlgili konular
Temel eserler
- pinkel-1986
- speicher-carter-2005
Sıkça sorulan sorular
- FISH karyotiplemeden nasıl farklıdır?
- Karyotipleme, tüm genomu düşük çözünürlükte taramakta ve dengeli yeniden düzenlenmeleri ve ploidiyi ortaya koymaktadır; oysa FISH, bölünmeyen interfaz hücreleri de dahil olmak üzere, yüksek hassasiyetle spesifik lokusları sorgulamak için etiketli problar kullanmaktadır. Bunlar tamamlayıcı yaklaşımlardır.
- FISH bölünme halindeki hücreler olmadan gerçekleştirilebilir mi?
- Evet. Hibridizasyon kromozom yoğunlaşmasına bağlı olmadığından, FISH interfaz çekirdeklerine uygulanabilmekte, bu da metafaz kromozomlarının kolayca elde edilemediği örneklerin analizine olanak tanımaktadır.