Konfokal ve Floresan Mikroskopi
Floresan mikroskopi, floresan molekülleri uyararak ve yaydıkları daha uzun dalga boylu ışığı toplayarak örnekleri görüntüler; bu da hücrelerin yüksek kontrastlı, moleküler olarak spesifik görüntülerini sağlamaktadır. Konfokal mikroskopi, odak dışı ışığı reddeden bir iğne deliği (pinhole) ekleyerek, hücrenin üç boyutlu görünümlerine dönüştürülebilen keskin optik kesitler üretmektedir.
Tanım
Floresan mikroskopi, işaretli yapıları görüntülemek için floroforlar tarafından ışığın emilimini ve yeniden yayılımını kullanmaktadır; konfokal mikroskopi ise, her görüntüye yalnızca ince bir odak içi düzlemin katkıda bulunmasını sağlamak üzere odak dışı ışığı dışarıda bırakan bir iğne deliği (pinhole) içeren bir floresan tekniğidir ve optik kesitler elde edilmesini sağlamaktadır.
Kapsam
Bu madde, floresan kontrast prensibini, konfokal görüntülemenin optik kesit alma avantajını ve floresan görüntülemeyi kırınım sınırının altına iten geniş süper çözünürlük yöntemleri sınıfını kapsamaktadır. Bu yöntemler, hücre biyolojisi içindeki görüntüleme teknikleri olarak ele alınmakta olup, klinik bir talimat olarak değerlendirilmemektedir.
Temel sorular
- Floresans, bir hücrede moleküler kontrastı nasıl sağlamaktadır?
- Bir konfokal iğne deliği (pinhole) optik kesitleri nasıl üretmektedir?
- Hücrelerin üç boyutlu görüntüleri nasıl yeniden yapılandırılmaktadır?
- Süper çözünürlük yöntemleri kırınım sınırını nasıl aşmaktadır?
Anahtar kavramlar
- Floresan uyarımı ve emisyonu
- Floroforlar ve floresan proteinler
- Konfokal iğne deliği (pinhole) ve optik kesit alma
- Üç boyutlu yeniden yapılandırma
- Fotobeyazlama (photobleaching) ve fototoksisite
- Süper çözünürlük (kırınım sınırsız) görüntüleme
Mekanizmalar
Floresan mikroskopide bir florofor, uyarma ışığını absorbe etmekte ve daha uzun bir dalga boyunda yeniden yaymaktadır; bu yayılım, koyu bir arka plana karşı parlak, spesifik kontrast sağlamak üzere filtreler aracılığıyla uyarmadan ayrılmaktadır, Lichtman ve Conchello tarafından incelendiği gibi. Ancak, geleneksel bir floresan görüntü, odak düzleminin üstünden ve altından gelen bulanıklaştırıcı ışık içermektedir; konfokal mikroskopi, odak noktasına eşlenik (conjugate) bir iğne deliği (pinhole) yerleştirerek odak dışı ışığın reddedilmesini sağlamakta ve Conchello ile Lichtman tarafından tanımlanan, üç boyutta istiflenebilen optik kesitleri üretmektedir. Emisyon, tüm ışık mikroskopisi gibi, hala kırınım sınırına tabi olduğundan, Hell ve Wichmann tarafından tanıtılan uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisi (stimulated-emission-depletion microscopy) gibi süper çözünürlük yaklaşımları, Schermelleh ve arkadaşları tarafından incelendiği üzere, bu sınırın çok altındaki ayrıntıları çözmek için floresan sürecinin kendisini manipüle etmektedir.
Klinik önem
Konfokal ve floresan mikroskopi, patoloji, oftalmoloji ve biyomedikal araştırmalarda molekülleri lokalize etmek ve dokuyu üç boyutta görüntülemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu madde, ilgili görüntüleme prensiplerini açıklamakta olup, bireysel tanı veya tedavi kararları için bir temel teşkil etmeyen referans-eğitim niteliğindedir.
Tarihçe
Konfokal prensip, 1950'lerde Marvin Minsky tarafından tasarlanmıştır; ancak pratik lazer taramalı konfokal mikroskoplar ile parlak sentetik ve genetik olarak kodlanmış floroforlar, yirminci yüzyılın sonlarından itibaren floresan görüntülemeyi hücre biyolojisinde baskın hale getirmiştir. Uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisi (stimulated-emission-depletion microscopy) (Hell & Wichmann, 1994) ve ilgili tekniklerle kırınım sınırının daha sonra aşılması, Schermelleh ve arkadaşları tarafından özetlenen süper çözünürlüklü floresan görüntüleme çağını başlatmıştır.
Öne çıkan isimler
- Jeff Lichtman
- Jose-Angel Conchello
- Stefan Hell
- Marvin Minsky
İlgili konular
Temel eserler
- lichtman-2005
- conchello-2005
- hell-1994
- schermelleh-2010
Sıkça sorulan sorular
- Konfokal iğne deliği (pinhole) ne işe yaramaktadır?
- Odak düzlemi dışından gelen ışığın engellenmesi ve yalnızca odak içi ışığın görüntüyü oluşturması için konumlandırılmaktadır; bu, diğerleriyle birleştirilerek üç boyutlu bir görünüm oluşturulabilen ince bir optik kesit üretmektedir.
- Floresan mikroskopi kırınım sınırını nasıl aşabilmektedir?
- Uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopisi (stimulated-emission-depletion microscopy) gibi süper çözünürlük yöntemleri, floresan emisyon sürecini kontrol ederek klasik kırınım sınırının çok altındaki ayrıntıların çözülmesini sağlayabilmektedir.