DNA Dizileme
DNA'daki baz dizisinin nasıl belirlendiği — Sanger'in zincir sonlandırma yönteminden, tüm genomları okuyan yüksek paralel teknolojilere kadar.
Tanım
DNA dizileme, bir DNA molekülündeki nükleotitlerin kesin sırasının belirlenmesidir; bu, tarihsel olarak zincir sonlandıran sentez ile başarılmış olup, günümüzde ağırlıklı olarak birçok parçayı eş zamanlı olarak okuyan yüksek paralel yöntemlerle gerçekleştirilmektedir.
Kapsam
Bu konu, DNA'nın nükleotit dizisini okuma yöntemlerini kapsamaktadır: zincir sonlandırma (Sanger) yöntemi ve baz spesifik sonlandırma prensibi ile onu takip eden ve genom ölçekli dizilemeyi rutin hale getiren yüksek verimli, yüksek paralel yaklaşımlar. Dizilemenin mantığını ele almaktadır; DNA'yı dizilemeye hazırlayan amplifikasyon ve klonlama, ilgili diğer konularda ele alınmaktadır.
Temel sorular
- Zincir sonlandırma dizilemesi bazların sırasını nasıl ortaya koymaktadır?
- İşaretli dideoksinükleotitler dizilemeyi neden pratik hale getirmiştir?
- Yüksek paralel yöntemler dizilemeyi tüm genomlara nasıl ölçeklendirmektedir?
- Kısa okumalar daha uzun dizilere ve genomlara nasıl birleştirilmektedir?
Temel kuramlar
- Zincir sonlandırma dizilemesi
- Zincir sonlandıran dideoksinükleotitlerin varlığında sentez, belirli bir bazın her oluşumunda sonlanan bir fragman seti üretmektedir ve bu fragmanları uzunluğa göre sıralamak, Sanger ve meslektaşları tarafından tanıtıldığı gibi diziyi ortaya koymaktadır.
- Yüksek paralel dizileme
- Çok sayıda DNA fragmanını aynı anda okumak ve diziyi bilgisayar ortamında yeniden yapılandırmak, maliyeti düşürmüş ve verimi önemli ölçüde artırarak rutin genom ölçekli dizilemeyi mümkün kılmıştır.
Mekanizmalar
Zincir sonlandırma dizilemesinde, bir primer, normal nükleotitlerin yanı sıra, bir kez dahil edildiğinde sentezi durduran az miktarda dideoksinükleotitlerin varlığında bir kalıp boyunca uzatılmaktadır; sonuç, terminal bazı bilinen iç içe geçmiş bir fragman setidir ve bu fragmanlar diziyi okumak için boyuta göre ayrılmaktadır. Modern yüksek paralel platformlar, birçok kalıp fragmanını immobilize etmekte ve amplifiye etmekte, aynı anda hepsinde baz dahilini tespit ederek, yazılımın tam diziye hizaladığı veya birleştirdiği çok sayıda kısa okuma üretmektedir.
Klinik önem
Dizileme, genetik tanı, kanser genomikleri, patojen sürveyansı ve tıpta kişiselleştirilmiş yaklaşımların temelini oluşturmaktadır; klinik rehberlik olarak değil, önem olarak sunulmaktadır.
Tarihçe
Sanger'in zincir sonlandırma yöntemi ve paralel Maxam–Gilbert kimyasal yöntemi, her ikisi de 1970'lerden itibaren, DNA dizilemesini uygulanabilir hale getirmiş ve Nobel tanınırlığı kazanmıştır; 2000'li yıllarda yüksek paralel teknolojilerin yükselişi, maliyetleri kat kat azaltmış ve genomik çağı başlatmıştır.
Öne çıkan isimler
- Frederick Sanger
- Walter Gilbert
İlgili konular
Temel eserler
- sanger1977
- lodish2016
Sıkça sorulan sorular
- Dideoksinükleotit nedir ve dizilemede neden kullanılmaktadır?
- Eklenir eklenmez daha fazla sentezi durduran modifiye bir nükleotittir; rastgele pozisyonlara dahil edilmesi, her bazda sonlanan ve diziyi ortaya koyan fragmanlar üretmektedir.
- Tüm genomlar günümüzde nasıl bu kadar hızlı dizilenebilmektedir?
- Yüksek paralel platformlar, milyonlarca DNA fragmanını aynı anda okumakta ve bunları birleştirmek için yazılım kullanmakta, bu da önceki yöntemlere kıyasla hızı büyük ölçüde artırmakta ve maliyeti düşürmektedir.