Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография разделяет нелетучие и термически лабильные соединения путем прокачивания жидкой подвижной фазы через колонку с мелкозернистым наполнителем под высоким давлением.

Definition

Высокоэффективная жидкостная хроматография — это метод разделения, при котором жидкая подвижная фаза под высоким давлением пропускается через колонку с мелкими частицами неподвижной фазы, разделяя аналиты по их дифференциальному взаимодействию с двумя фазами.

Scope

Данная тема охватывает жидкостную хроматографию в ее высокоэффективной форме: насосы и градиентные системы, колонки, заполненные мелкими пористыми частицами, основные режимы разделения — обращенно-фазовый, нормально-фазовый, ионообменный и эксклюзионный — а также детекторы, включая ультрафиолетовый, диодно-матричный, флуоресцентный и масс-спектрометрический. Рассматриваются разработка методов, роль состава подвижной фазы в селективности и количественное определение по площадям пиков.

Core questions

• Чем отличаются механизмы удерживания в таких режимах разделения, как обращенно-фазовый и ионообменный?
• Как состав подвижной фазы, включая градиентное элюирование, контролирует селективность и время анализа?
• Почему меньшие частицы неподвижной фазы улучшают эффективность и какой ценой?
• Как выбираются детекторы ВЭЖХ по чувствительности, селективности и идентификации?

Key theories

Удерживание в обращенно-фазовом режиме

В доминирующем обращенно-фазовом режиме неполярная неподвижная фаза удерживает аналиты пропорционально их гидрофобности из полярной водно-органической подвижной фазы; увеличение органической фракции уменьшает удерживание, обеспечивая настраиваемое, широко применимое разделение органических соединений.

Mechanisms

Насос высокого давления прокачивает жидкую подвижную фазу через колонку, заполненную пористыми частицами с химически связанной неподвижной фазой. Проба, введенная в поток, разделяется по мере распределения каждого аналита между подвижной и неподвижной фазами в соответствии с его химическими свойствами; изменение состава подвижной фазы во время анализа (градиентное элюирование) улучшает и ускоряет разделение. Элюируемые аналиты проходят через детектор, площади пиков которого позволяют количественно определить их по калибровочным стандартам.

Clinical relevance

Высокоэффективная жидкостная хроматография является доминирующим методом для фармацевтического анализа и профилирования примесей, измерения терапевтических лекарств и метаболитов, анализа пищевых продуктов и природных продуктов, а также характеристики биомолекул, и является ведущим интерфейсом для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.

History

Современная жидкостная хроматография появилась в конце 1960-х и 1970-х годах, когда насосы, мелкодисперсные наполнители и чувствительные детекторы позволили проводить жидкостные разделения под высоким давлением. Обращенно-фазовые колонки с химически связанным кремнеземом стали основным рабочим режимом, а последующий переход к частицам размером менее двух микрометров привел к созданию сверхвысокоэффективных систем с более быстрыми и эффективными разделениями.

Key figures

• Lloyd Snyder
• Joseph Jack Kirkland
• Csaba Horváth

Seminal works

• snyder2010
• skoog2017

Frequently asked questions

Что такое обращенно-фазовая хроматография?

Это наиболее распространенный режим ВЭЖХ, использующий неполярную неподвижную фазу и полярную подвижную фазу, поэтому более гидрофобные аналиты удерживаются дольше; он подходит для очень широкого круга органических и биоорганических соединений.

Чем ВЭЖХ отличается от газовой хроматографии?

ВЭЖХ использует жидкую подвижную фазу и работает при температурах, близких к комнатным, поэтому она позволяет анализировать нелетучие, полярные и термически лабильные соединения, которые не могут быть проанализированы газовой хроматографией.