Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência separa compostos não voláteis e termicamente lábeis bombeando uma fase móvel líquida através de uma coluna de empacotamento fino sob alta pressão.

Definition

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica de separação na qual uma fase móvel líquida é forçada sob alta pressão através de uma coluna de partículas finas de fase estacionária, separando os analitos por sua interação diferencial com as duas fases.

Scope

Este tópico abrange a cromatografia líquida em sua forma de alta eficiência: bombas e sistemas de gradiente, colunas empacotadas com pequenas partículas porosas, os principais modos de separação — fase reversa, fase normal, troca iônica e exclusão por tamanho — e detectores, incluindo ultravioleta, arranjo de diodos, fluorescência e espectrometria de massa. Aborda o desenvolvimento de métodos, o papel da composição da fase móvel na seletividade e a quantificação a partir das áreas dos picos.

Core questions

• Como os modos de separação, como fase reversa e troca iônica, diferem em seu mecanismo de retenção?
• Como a composição da fase móvel, incluindo a eluição por gradiente, controla a seletividade e o tempo de corrida?
• Por que partículas menores de fase estacionária melhoram a eficiência e a que custo?
• Como os detectores de HPLC são escolhidos para sensibilidade, seletividade e identificação?

Key theories

Retenção em fase reversa

No modo dominante de fase reversa, uma fase estacionária não polar retém os analitos em proporção à sua hidrofobicidade a partir de uma fase móvel aquosa-orgânica polar; o aumento da fração orgânica reduz a retenção, proporcionando uma separação ajustável e amplamente aplicável de compostos orgânicos.

Mechanisms

Uma bomba de alta pressão impulsiona uma fase móvel líquida através de uma coluna empacotada com partículas porosas que contêm uma fase estacionária ligada. Uma amostra injetada no fluxo se separa à medida que cada analito se distribui entre as fases móvel e estacionária de acordo com sua química; a alteração da composição da fase móvel durante a corrida, a eluição por gradiente, aprimora e acelera a separação. Os analitos eluídos passam por um detector cujas áreas de pico os quantificam em relação aos padrões de calibração.

Clinical relevance

A cromatografia líquida de alta eficiência é o método dominante para ensaios farmacêuticos e perfil de impurezas, medição de fármacos terapêuticos e metabólitos, análise de alimentos e produtos naturais, e caracterização de biomoléculas, sendo a principal interface para a cromatografia líquida-espectrometria de massa.

History

A cromatografia líquida moderna surgiu no final dos anos 1960 e 1970, à medida que bombas, empacotamentos de partículas finas e detectores sensíveis permitiram separações líquidas sob alta pressão. As colunas de fase reversa com sílica ligada tornaram-se o modo de trabalho principal, e a posterior mudança para partículas sub-dois micrômetros produziu sistemas de ultra-alta eficiência com separações mais rápidas e eficientes.

Key figures

• Lloyd Snyder
• Joseph Jack Kirkland
• Csaba Horváth

Seminal works

• snyder2010
• skoog2017

Frequently asked questions

O que é cromatografia de fase reversa?

É o modo de HPLC mais comum, utilizando uma fase estacionária não polar e uma fase móvel polar, de modo que analitos mais hidrofóbicos são retidos por mais tempo; é adequado para uma ampla gama de compostos orgânicos e bio-orgânicos.

Como a HPLC difere da cromatografia gasosa?

A HPLC utiliza uma fase móvel líquida e funciona em temperaturas próximas à ambiente, portanto, lida com compostos não voláteis, polares e termicamente frágeis que não podem ser analisados por cromatografia gasosa.