Imuno-histoquímica e Imunofluorescência

A imuno-histoquímica (IHQ) e a imunofluorescência utilizam anticorpos para localizar moléculas específicas numa secção de tecido. Um anticorpo liga-se ao seu antigénio alvo in situ e é então tornado visível — por uma enzima que deposita um produto colorido (IHQ) ou por um marcador fluorescente visualizado sob um microscópio de fluorescência (imunofluorescência) — permitindo a identificação de tipos celulares e moléculas que as colorações de rotina não conseguem distinguir.

Definition

Imuno-histoquímica e imunofluorescência são métodos baseados em anticorpos que localizam antigénios específicos em secções de tecido, ligando anticorpos marcados aos seus alvos e detetando o marcador ligado através de reações de cor enzimáticas (imuno-histoquímica) ou fluorescência (imunofluorescência).

Scope

Este tópico abrange o princípio da marcação baseada em anticorpos, deteção direta e indireta, sistemas de amplificação de sinal, recuperação antigénica e a validação e controlo de qualidade destes ensaios. É uma referência metodológica e não fornece interpretação clínica ou orientação de tratamento.

Core questions

• Como um anticorpo consegue a localização molecular-específica no tecido?
• Como diferem os esquemas de deteção direta e indireta?
• Como os sistemas de amplificação e a recuperação antigénica melhoram a sensibilidade?
• Como os ensaios baseados em anticorpos são validados e controlados para uma interpretação fiável?

Key concepts

• Especificidade de ligação antigénio-anticorpo
• Deteção direta vs indireta
• Amplificação de sinal (por exemplo, avidina-biotina, sistemas poliméricos)
• Marcadores cromogénicos vs fluorescentes
• Recuperação de antigénio (epítopo)
• Controlos e validação de ensaios
• Especificidade e reatividade cruzada

Mechanisms

O evento central é a ligação específica de um anticorpo ao seu antigénio dentro da secção. No método direto, o próprio anticorpo primário carrega o marcador; no método indireto, um anticorpo primário não marcado é detetado por um anticorpo secundário marcado, o que amplifica e padroniza a deteção. Coons e colegas mostraram pela primeira vez que um anticorpo marcado com um grupo fluorescente poderia localizar o seu antigénio no tecido (Coons, 1941), estabelecendo a imunofluorescência. A deteção baseada em enzimas permitiu então sinais cromogénicos permanentes, e a sensibilidade foi aumentada por sistemas de amplificação como o complexo avidina-biotina-peroxidase (Hsu et al., 1981) e, posteriormente, a deteção baseada em polímeros. Como a fixação por aldeído pode mascar epítopos através de ligações cruzadas, são frequentemente utilizados passos de recuperação antigénica baseados em calor ou protease para restaurar a ligação do anticorpo em tecido fixado em formalina e incluído em parafina (Shi et al., 1991). A interpretação fiável depende de controlos positivos e negativos apropriados e da validação analítica formal de cada ensaio (Fitzgibbons et al., 2014).

Clinical relevance

A marcação baseada em anticorpos sustenta grande parte do diagnóstico e pesquisa modernos baseados em tecidos, identificando a linhagem celular e marcadores moleculares específicos. Esta entrada descreve os métodos e os seus requisitos de qualidade de forma conceptual; é uma orientação de referência e não uma base para decisões individuais de diagnóstico ou tratamento.

Evidence & guidelines

Orientações profissionais sobre a validação analítica de ensaios imuno-histoquímicos foram emitidas pelo College of American Pathologists (Fitzgibbons et al., 2014), e os princípios do método estão consolidados em referências padrão de histotecnologia (Suvarna et al., 2018). Os métodos de recuperação antigénica e amplificação derivam de estudos primários fundamentais (Shi et al., 1991; Hsu et al., 1981).

History

A localização baseada em anticorpos começou com o método de anticorpos fluorescentes de Coons e colegas em 1941, que tornou possível a deteção molecular-específica em tecido. Os métodos de marcação enzimática posteriormente forneceram sinais visíveis permanentes, sistemas de amplificação como o complexo avidina-biotina-peroxidase (Hsu et al., 1981) aumentaram a sensibilidade, e a recuperação antigénica induzida por calor (Shi et al., 1991) estendeu a imunocoloração fiável a material rotineiramente fixado e incluído em parafina. A padronização e as orientações de validação seguiram-se à medida que os métodos se tornaram centrais para a prática diagnóstica (Fitzgibbons et al., 2014).

Key figures

• Albert Coons
• Su-Ming Hsu
• Shan-Rong Shi

Seminal works

• coons-1941
• hsu-1981
• shi-1991

Frequently asked questions

Qual é a diferença entre imuno-histoquímica e imunofluorescência?

Ambas utilizam anticorpos para localizar antigénios no tecido; a imuno-histoquímica visualiza o anticorpo ligado através de uma enzima que deposita um produto colorido visto por microscopia de luz, enquanto a imunofluorescência utiliza um marcador fluorescente visualizado sob um microscópio de fluorescência.

Por que a recuperação antigénica é frequentemente necessária?

A fixação em formalina forma ligações cruzadas entre proteínas e pode mascar os epítopos que os anticorpos reconhecem; os passos de recuperação antigénica baseados em calor ou enzimas podem desmascarar esses epítopos para que a coloração se torne possível em tecido fixado em formalina e incluído em parafina.