Identificazione di patogeni mediante metagenomica e sequenziamento dell'intero genoma

Gli approcci metagenomici e di sequenziamento dell'intero genoma utilizzano il sequenziamento ad alta produttività per caratterizzare i patogeni su scala genomica. Il sequenziamento metagenomico legge gli acidi nucleici direttamente da campioni clinici senza mirare a un organismo specifico, mentre il sequenziamento dell'intero genoma legge il genoma completo di un isolato coltivato, supportando l'identificazione, la tipizzazione e la sorveglianza ad alta risoluzione.

Definition

Il sequenziamento metagenomico è il sequenziamento non mirato di tutti gli acidi nucleici in un campione clinico per rilevare qualsiasi organismo presente, mentre il sequenziamento dell'intero genoma è il sequenziamento del genoma completo di un singolo organismo, tipicamente da un isolato coltivato, per una caratterizzazione dettagliata.

Scope

L'argomento copre il sequenziamento di nuova generazione metagenomico indipendente dalla coltura per il rilevamento non distorto di patogeni e il sequenziamento dell'intero genoma di isolati per l'identificazione, la tipizzazione e l'indagine di focolai. Si notano inoltre le considerazioni analitiche, interpretative e di costo che questi metodi sollevano. Viene presentato come un argomento di laboratorio e di riferimento senza indicazioni terapeutiche.

Core questions

• Quali organismi sono presenti in un campione quando la causa è sconosciuta o la coltura è fallita?
• Cosa rivela il genoma completo di un isolato sulla sua identità, tipizzazione e resistenza?
• Come vengono interpretate le letture di sequenziamento per separare i veri patogeni dallo sfondo e dalla contaminazione?
• Quando i benefici del sequenziamento su scala genomica giustificano il suo costo e la sua complessità?

Key concepts

• Sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS)
• Sequenziamento dell'intero genoma (WGS)
• Rilevamento indipendente dalla coltura (non mirato)
• Epidemiologia genomica
• Interpretazione delle letture, sfondo e contaminazione
• Pipeline bioinformatiche e database di riferimento
• Efficacia dei costi dei metodi su scala genomica

Mechanisms

Il sequenziamento metagenomico estrae e sequenzia gli acidi nucleici direttamente da un campione clinico, quindi utilizza pipeline bioinformatiche per assegnare le letture agli organismi, in linea di principio rilevando batteri, virus, funghi e parassiti senza ipotesi preliminari, compresi agenti che coltivano male, come nella diagnosi di neuroleptospirosi da liquido cerebrospinale (Wilson et al., 2014). Poiché i campioni contengono anche acidi nucleici dell'ospite e ambientali, l'interpretazione deve distinguere i patogeni genuini dallo sfondo e dalla contaminazione, una sfida centrale nell'uso clinico (Miller & Chiu, 2020). Il sequenziamento dell'intero genoma legge invece l'intero genoma di un isolato coltivato, fornendo la massima risoluzione per l'identificazione, la tipizzazione e la caratterizzazione della resistenza e supportando l'epidemiologia genomica dei focolai (Deng et al., 2016).

Clinical relevance

Il sequenziamento su scala genomica descrive come i laboratori possono rilevare patogeni inaspettati o non coltivabili e ricostruire focolai ad alta risoluzione, informando la diagnosi di casi difficili e la sorveglianza per la prevenzione delle infezioni. L'argomento spiega come vengono generate queste prove e non costituisce una base per decisioni diagnostiche o terapeutiche individuali.

Epidemiology

Il sequenziamento dell'intero genoma è diventato uno strumento primario dell'epidemiologia genomica, consentendo la sorveglianza dettagliata e l'indagine di focolai di patogeni batterici, compresi organismi di origine alimentare e associati all'assistenza sanitaria (Deng et al., 2016). Valutazioni economiche hanno esaminato se tale sorveglianza sia economicamente vantaggiosa rispetto ai metodi tradizionali (Price et al., 2023).

Evidence & guidelines

Le prove su questi metodi includono applicazioni cliniche proof-of-concept del sequenziamento metagenomico (Wilson et al., 2014), critiche al suo ruolo clinico (Miller & Chiu, 2020), revisioni della sorveglianza genomica dell'intero genoma (Deng et al., 2016) e revisioni sistematiche delle sue valutazioni economiche (Price et al., 2023). Gli standard di validazione e rendicontazione per i saggi di sequenziamento clinico sono stabiliti da organismi professionali e normativi e non sono riprodotti qui.

History

La microbiologia su scala genomica ha seguito la diminuzione del costo del sequenziamento ad alta produttività. Il sequenziamento dell'intero genoma di isolati è stato adottato per la sorveglianza e l'indagine di focolai (Deng et al., 2016), e il sequenziamento metagenomico non mirato ha dimostrato il suo potenziale diagnostico in casi come l'identificazione di un patogeno non coltivabile da liquido cerebrospinale (Wilson et al., 2014), stimolando un dibattito in corso su come e quando impiegarlo clinicamente (Miller & Chiu, 2020).

Debates

Il sequenziamento metagenomico dovrebbe essere utilizzato routinariamente nel laboratorio clinico?

Il sequenziamento metagenomico può rilevare patogeni che altri metodi non rilevano, ma l'alto costo, la complessità interpretativa e la difficoltà di separare il segnale reale dallo sfondo mantengono il suo ruolo clinico di routine contestato.

La sorveglianza genomica dell'intero genoma è economicamente vantaggiosa?

Il sequenziamento dell'intero genoma offre una risoluzione superiore per la sorveglianza, ma il suo valore rispetto a metodi convenzionali più economici dipende dal contesto e dal patogeno, e le prove economiche sono ancora in fase di assemblaggio.

Seminal works

• wilson-2014
• deng-2016
• miller-2020

Frequently asked questions

In che modo il sequenziamento metagenomico differisce dal sequenziamento dell'intero genoma?

Il sequenziamento metagenomico legge tutti gli acidi nucleici in un campione per rilevare qualsiasi organismo presente senza mirarne uno, mentre il sequenziamento dell'intero genoma legge il genoma completo di un singolo organismo, solitamente un isolato coltivato, per una caratterizzazione dettagliata.

Perché l'interpretazione dei risultati metagenomici è impegnativa?

I campioni clinici contengono acidi nucleici dell'ospite, ambientali e contaminanti accanto a qualsiasi patogeno, quindi distinguere un vero organismo causale dallo sfondo richiede un'attenta interpretazione bioinformatica e clinica.