Diagnosi molecolare di funghi e parassiti

La diagnosi molecolare di funghi e parassiti applica metodi basati sugli acidi nucleici per rilevare e identificare funghi e parassiti che sono spesso a crescita lenta, difficili da coltivare o difficili da riconoscere al microscopio. Marcatori sequenziali e saggi di amplificazione estendono la portata diagnostica dove i metodi convenzionali sono limitati.

Definition

La diagnosi molecolare di funghi e parassiti è l'uso di metodi molecolari — amplificazione, ibridazione e sequenziamento di regioni marcatore — per rilevare e identificare funghi e parassiti in campioni clinici o isolati.

Scope

L'argomento copre il DNA barcoding dei funghi (in particolare la regione dell'interspazio trascritto interno), il rilevamento basato su PCR di patogeni fungini e parassitari, e i punti di forza e i limiti di questi metodi rispetto alla coltura e alla microscopia. È inquadrato come argomento di laboratorio e di riferimento senza indicazioni sul trattamento o sul dosaggio.

Core questions

• Quale organismo fungino o parassitario è presente e quale regione marcatore lo identifica meglio?
• Come si confrontano i metodi molecolari con la microscopia e la coltura in termini di sensibilità e specificità?
• Quando i saggi molecolari indipendenti dalla coltura aggiungono valore diagnostico?

Key concepts

• Regione ITS come marcatore barcode fungino
• Rilevamento di patogeni basato su PCR
• Sonde a DNA
• Pannelli molecolari multiplex
• Diagnosi indipendente dalla coltura
• Selezione di marcatori e database di riferimento

Mechanisms

Per i funghi, la regione dell'interspazio trascritto interno (ITS) ribosomiale nucleare serve come barcode universale ampiamente adottato che, quando sequenziato e confrontato con database di riferimento, identifica la maggior parte dei funghi a livello di genere o specie (Schoch et al., 2012). I saggi basati su PCR amplificano bersagli specifici dell'organismo per rilevare i funghi direttamente nel materiale clinico, il che può essere prezioso per le malattie invasive dove la coltura è lenta o insensibile, sebbene la loro prontezza clinica vari a seconda del contesto (Nguyen & Clancy, 2018). Per i parassiti, le sonde a DNA e la PCR sono state stabilite precocemente come alternative più sensibili ad alcuni metodi convenzionali (Weiss, 1995), e saggi basati su PCR e multiplex sono ora applicati per rilevare e differenziare parassiti intestinali e altri nel laboratorio clinico (Verweij & Stensvold, 2014).

Clinical relevance

La diagnostica molecolare fungina e parassitaria descrive come i laboratori rilevano e identificano organismi che la coltura e la microscopia possono trascurare, informando la refertazione diagnostica e la sorveglianza. L'argomento spiega come vengono generate queste evidenze e non costituisce una base per decisioni diagnostiche o terapeutiche individuali.

Epidemiology

Il rilevamento molecolare ha migliorato il riconoscimento e la differenziazione delle infezioni fungine e parassitarie, in particolare per gli organismi difficili da coltivare o da distinguere morfologicamente, supportando una valutazione più accurata della loro occorrenza a livello di popolazione (Verweij & Stensvold, 2014; Weiss, 1995).

Evidence & guidelines

L'identificazione fungina basata su marcatori si basa sul lavoro di consorzi che hanno stabilito la regione ITS come barcode universale (Schoch et al., 2012), mentre le revisioni riassumono le prestazioni cliniche e i limiti dei saggi fungini e parassitari basati su PCR (Nguyen & Clancy, 2018; Verweij & Stensvold, 2014). Gli standard specifici dei saggi sono stabiliti da organismi professionali e produttori e non sono riprodotti qui.

History

I metodi molecolari sono entrati nella micologia e nella parassitologia poiché la PCR e il rilevamento basato su sonde hanno dimostrato una maggiore sensibilità rispetto ad alcune tecniche tradizionali (Weiss, 1995). L'adozione formale della regione ITS come barcode fungino universale ha standardizzato l'identificazione fungina molecolare (Schoch et al., 2012), e i saggi parassitologici basati su PCR si sono progressivamente diffusi nei laboratori clinici di routine (Verweij & Stensvold, 2014).

Debates

I saggi fungini molecolari sono pronti a sostituire la diagnosi convenzionale?

I saggi fungini basati su PCR possono aggiungere sensibilità e velocità per le malattie invasive, ma la variabilità nella standardizzazione e nella validazione clinica fa sì che vengano spesso utilizzati per integrare piuttosto che sostituire la coltura e il test antigenico.

Seminal works

• schoch-2012
• weiss-1995
• verweij-2014

Frequently asked questions

Perché la regione ITS viene utilizzata per identificare i funghi?

La regione dell'interspazio trascritto interno combina una conservazione sufficiente per essere amplificata attraverso i funghi con una variabilità sufficiente per distinguere molte specie, il che ha portato alla sua adozione come DNA barcode fungino universale.

I metodi molecolari sostituiscono la microscopia e la coltura per i parassiti?

I metodi molecolari spesso aggiungono sensibilità e la capacità di differenziare le specie, ma sono comunemente usati insieme alla microscopia e ad altri metodi piuttosto che come sostituzione completa, a seconda dell'organismo e del contesto clinico.