Spectroscopie de fluorescence moléculaire

La spectroscopie de fluorescence moléculaire mesure la lumière émise par les molécules après qu'elles aient absorbé un rayonnement, offrant une quantification très sensible et sélective.

Definition

La spectroscopie de fluorescence moléculaire est une méthode analytique basée sur la luminescence qui quantifie les analytes à partir de l'intensité de la lumière qu'ils émettent en revenant d'un état électronique excité à l'état fondamental.

Scope

Ce sujet couvre les méthodes de photoluminescence utilisées en analyse — principalement la fluorescence, avec la phosphorescence et la chimiluminescence associées. Il aborde le processus d'excitation et d'émission, l'instrumentation d'un spectrofluorimètre avec ses sélecteurs de longueur d'onde d'excitation et d'émission séparés, les facteurs qui régissent l'intensité de fluorescence et le rendement quantique, ainsi que les effets d'extinction (quenching) et de filtre interne qui compliquent la quantification.

Core questions

• Comment l'absorption et l'émission se combinent-elles pour produire un signal de fluorescence, et pourquoi est-il si sensible ?
• Quelles caractéristiques moléculaires rendent un composé fortement fluorescent ?
• Comment l'extinction et les effets de filtre interne faussent-ils les mesures de fluorescence ?
• Quand la fluorescence est-elle préférable à l'absorption pour l'analyse de traces ?

Key theories

Excitation et émission avec décalage de Stokes

Une molécule absorbe un photon pour atteindre un état singulet excité, perd de l'énergie de manière non radiative jusqu'au niveau vibrationnel le plus bas, puis émet un photon de longueur d'onde plus longue ; ce décalage de Stokes sépare l'émission de l'excitation et est à la base de la sensibilité et de la sélectivité de la fluorescence, représenté de manière compacte par le diagramme de Jablonski.

Mechanisms

L'absorption de lumière ultraviolette ou visible élève une molécule à un état singulet excité. La relaxation vibrationnelle la ramène au niveau excité le plus bas, d'où elle peut émettre un photon de fluorescence d'énergie inférieure. Étant donné que l'émission est mesurée sur un fond quasi-sombre plutôt que comme une faible variation d'un signal transmis important, la fluorescence peut atteindre des limites de détection bien inférieures à celles de l'absorption. L'intensité est proportionnelle à la concentration à faible absorbance, mais elle est réduite par l'extinction (quenching) et par l'absorption par filtre interne à des concentrations plus élevées.

Clinical relevance

Les méthodes de fluorescence sont centrales en bioanalyse et en diagnostic clinique, incluant les immunoessais, la quantification et la détection de séquençage des acides nucléiques, la cytométrie en flux et l'analyse de traces environnementales, en raison de leur haute sensibilité et de la disponibilité de marqueurs fluorescents sélectifs.

History

George Stokes a décrit et nommé la fluorescence au milieu du XIXe siècle, observant le décalage caractéristique vers des longueurs d'onde plus longues. La représentation des niveaux d'énergie organisée par Jabłoński dans les années 1930 a clarifié les voies radiatives et non radiatives concurrentes, et le développement de spectrofluorimètres sensibles basés sur des photomultiplicateurs a établi la fluorescence comme une technique d'analyse de traces de premier plan.

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

Pourquoi la fluorescence est-elle généralement plus sensible que l'absorption ?

La fluorescence est mesurée comme une lumière émise sur un fond sombre, de sorte qu'un signal même faible se distingue, tandis que l'absorption nécessite de détecter une petite diminution dans un faisceau transmis important, ce qui limite la concentration minimale mesurable.

Qu'est-ce que l'effet de filtre interne ?

À une absorbance plus élevée de l'analyte ou de la matrice, une partie de la lumière d'excitation et une partie de la lumière émise sont réabsorbées avant d'atteindre le détecteur, de sorte que l'intensité de fluorescence n'augmente plus linéairement avec la concentration et peut même diminuer.