Spectroscopie d'absorption UV-visible
La spectroscopie d'absorption UV-visible mesure l'atténuation de la lumière ultraviolette ou visible par un échantillon afin de quantifier les analytes via des transitions électroniques.
Definition
La spectroscopie d'absorption UV-visible est une méthode spectroscopique moléculaire qui détermine la concentration d'un analyte à partir de la fraction de rayonnement ultraviolet ou visible absorbée lors de transitions électroniques.
Scope
Ce sujet aborde l'instrumentation et la pratique de la mesure de l'absorption moléculaire entre environ 190 et 800 nm : les sources continues et à raies, les monochromateurs et les réseaux de photodiodes, les spectrophotomètres à simple et double faisceau, ainsi que l'application de la loi de Beer-Lambert à la détermination quantitative. Il inclut les méthodes colorimétriques dans lesquelles une réaction chromogène rend un analyte non absorbant mesurable.
Core questions
- Comment l'absorbance est-elle liée à la concentration par la loi de Beer-Lambert ?
- Quels chromophores et transitions électroniques donnent lieu à l'absorption UV-visible ?
- Comment les réactifs colorimétriques sont-ils utilisés pour rendre détectables les analytes non absorbants ?
- Quelles sources d'erreur — lumière parasite, déviation de la loi de Beer, bruit instrumental — limitent la précision ?
Key theories
- Loi de Beer-Lambert
- L'absorbance est égale au produit de l'absorptivité molaire (ou coefficient d'extinction molaire), de la longueur du trajet optique et de la concentration, permettant une quantification directe à partir d'une seule mesure par rapport à un étalonnage ; la loi suppose un rayonnement monochromatique, des solutions diluées et l'absence de déviations chimiques ou instrumentales.
Mechanisms
L'absorption se produit lorsqu'un photon promeut un électron d'une orbitale moléculaire à l'état fondamental vers une orbitale de plus haute énergie ; l'écart énergétique détermine la longueur d'onde absorbée, et l'absorptivité molaire (ou coefficient d'extinction molaire) reflète la probabilité de transition. Un spectrophotomètre mesure le rapport de l'intensité transmise à l'intensité incidente, le rapporte sous forme de transmittance, et le convertit logarithmiquement en absorbance, qui est proportionnelle à la concentration sur la plage linéaire.
Clinical relevance
La spectrophotométrie UV-visible est à la base d'innombrables dosages de routine : la quantification des protéines et des acides nucléiques, les tests enzymatiques de chimie clinique, la mesure des espèces dissoutes dans l'analyse de l'eau, ainsi que les essais pharmaceutiques et les tests de dissolution.
History
La base quantitative de la méthode remonte aux travaux de Bouguer et Lambert sur l'atténuation de la lumière au XVIIIe siècle et à la démonstration de Beer en 1852 selon laquelle l'absorption est proportionnelle à la concentration. Les spectrophotomètres photoélectriques pratiques sont apparus dans les années 1940, et les instruments à barrettes de diodes ont ensuite permis une acquisition rapide du spectre complet.
Key figures
- August Beer
- Pierre Bouguer
- Johann Heinrich Lambert
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Seminal works
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Frequently asked questions
- Quelle est la différence entre la transmittance et l'absorbance ?
- La transmittance est la fraction de lumière incidente qui traverse l'échantillon ; l'absorbance est le logarithme négatif de la transmittance et est directement proportionnelle à la concentration, c'est pourquoi les travaux quantitatifs utilisent l'absorbance.
- Pourquoi mesure-t-on un blanc en spectroscopie UV-visible ?
- Un blanc contenant tout sauf l'analyte corrige l'absorption et la réflexion par le solvant, la cuvette et les réactifs, de sorte que l'absorbance mesurée ne reflète que l'analyte.