Chromatographie en phase liquide à haute performance
La chromatographie en phase liquide à haute performance sépare les composés non volatils et thermiquement labiles en pompant une phase mobile liquide à travers une colonne de garnissage fin sous haute pression.
Definition
La chromatographie en phase liquide à haute performance est une technique de séparation dans laquelle une phase mobile liquide est forcée sous haute pression à travers une colonne de fines particules de phase stationnaire, séparant les analytes par leur interaction différentielle avec les deux phases.
Scope
Ce sujet couvre la chromatographie en phase liquide sous sa forme à haute performance : les pompes et les systèmes de gradient, les colonnes garnies de petites particules poreuses, les principaux modes de séparation — phase inverse, phase normale, échange d'ions et exclusion stérique — et les détecteurs, y compris ultraviolet, barrette de diodes, fluorescence et spectrométrie de masse. Il aborde le développement de méthodes, le rôle de la composition de la phase mobile dans la sélectivité et la quantification à partir des aires de pic.
Core questions
- Comment les modes de séparation tels que la phase inverse et l'échange d'ions diffèrent-ils dans leur mécanisme de rétention ?
- Comment la composition de la phase mobile, y compris l'élution par gradient, contrôle-t-elle la sélectivité et le temps d'analyse ?
- Pourquoi les particules de phase stationnaire plus petites améliorent-elles l'efficacité, et à quel coût ?
- Comment les détecteurs HPLC sont-ils choisis pour leur sensibilité, leur sélectivité et leur identification ?
Key theories
- Rétention en phase inverse
- Dans le mode dominant en phase inverse, une phase stationnaire non polaire retient les analytes proportionnellement à leur hydrophobicité à partir d'une phase mobile aqueuse-organique polaire ; l'augmentation de la fraction organique réduit la rétention, offrant une séparation ajustable et largement applicable des composés organiques.
Mechanisms
Une pompe à haute pression entraîne une phase mobile liquide à travers une colonne garnie de particules poreuses portant une phase stationnaire liée. Un échantillon injecté dans le flux se sépare à mesure que chaque analyte se répartit entre les phases mobile et stationnaire selon sa chimie ; la modification de la composition de la phase mobile pendant l'analyse, l'élution par gradient, affine et accélère la séparation. Les analytes élués passent à travers un détecteur dont les aires de pic les quantifient par rapport à des étalons de calibration.
Clinical relevance
La chromatographie en phase liquide à haute performance est la méthode dominante pour l'analyse pharmaceutique et le profilage des impuretés, la mesure des médicaments thérapeutiques et de leurs métabolites, l'analyse des aliments et des produits naturels, et la caractérisation des biomolécules, et constitue l'interface principale pour la chromatographie liquide-spectrométrie de masse.
History
La chromatographie liquide moderne est apparue à la fin des années 1960 et dans les années 1970, lorsque les pompes, les garnissages à particules fines et les détecteurs sensibles ont permis des séparations liquides sous haute pression. Les colonnes en phase inverse avec de la silice greffée sont devenues le mode de travail principal, et le passage ultérieur à des particules de moins de deux micromètres a produit des systèmes à ultra-haute performance avec des séparations plus rapides et plus efficaces.
Key figures
- Lloyd Snyder
- Joseph Jack Kirkland
- Csaba Horváth
Related topics
Seminal works
- snyder2010
- skoog2017
Frequently asked questions
- Qu'est-ce que la chromatographie en phase inverse ?
- C'est le mode HPLC le plus courant, utilisant une phase stationnaire non polaire et une phase mobile polaire, de sorte que les analytes plus hydrophobes sont retenus plus longtemps ; il convient à une très large gamme de composés organiques et bio-organiques.
- En quoi la HPLC diffère-t-elle de la chromatographie en phase gazeuse ?
- La HPLC utilise une phase mobile liquide et fonctionne à des températures proches de l'ambiante, elle peut donc traiter des composés non volatils, polaires et thermiquement fragiles qui ne peuvent pas être analysés par chromatographie en phase gazeuse.