تکنیکهای میکروسکوپی و ایمونوفلورسانس
میکروسکوپی و ایمونوفلورسانس ویروسها را با مشاهده مستقیم ذرات ویروسی یا آنتیژنهای ویروسی در داخل سلولهای آلوده شناسایی میکنند. میکروسکوپ الکترونی مورفولوژی ذرات ویروسی را مستقیماً نشان میدهد، در حالی که ایمونوفلورسانس از آنتیبادیهای نشاندار شده با فلورسنت برای روشن کردن پروتئینهای ویروسی خاص زیر میکروسکوپ فلورسنت استفاده میکند و ویژگی اتصال آنتیبادی را با جزئیات فضایی میکروسکوپی ترکیب میکند.
Definition
تکنیکهای میکروسکوپی و ایمونوفلورسانس روشهای شناسایی مبتنی بر مشاهده هستند که یا ذرات ویروسی را مستقیماً تصویربرداری میکنند (میکروسکوپ الکترونی) یا آنتیژنهای ویروسی را در سلولها با استفاده از آنتیبادیهای نشاندار شده با فلورسنت آشکار میسازند (ایمونوفلورسانس).
Scope
این موضوع روشهای آنتیبادی فلورسنت (ایمونوفلورسانس مستقیم و غیرمستقیم) را برای شناسایی آنتیژنهای ویروسی در سلولها و بافتها، و رویکردهای میکروسکوپ الکترونی مانند رنگآمیزی منفی برای مشاهده ذرات ویروسی پوشش میدهد. این مقاله اصول و کاربردهای آن را در سطح مرجع توضیح میدهد و پروتکلها یا توصیههای مدیریت بالینی را ارائه نمیدهد.
Core questions
- چه زمانی مشاهده یک ذره ویروسی یا آنتیژن آن آموزندهتر از شناسایی ژنوم آن است؟
- ایمونوفلورسانس مستقیم و غیرمستقیم در نحوه تحویل نشانگر چه تفاوتی دارند؟
- مورفولوژی میکروسکوپ الکترونی چه چیزی را میتواند آشکار کند زمانی که هویت یک ویروس ناشناخته است؟
- ویژگی اتصال آنتیبادی و کیفیت نمونه چگونه بر تفسیر تأثیر میگذارند؟
Key concepts
- آزمایش آنتیبادی فلورسنت مستقیم (DFA)
- آزمایش ایمونوفلورسانس غیرمستقیم (IFA)
- آنتیبادی نشاندار شده با فلوروفور
- میکروسکوپ الکترونی
- رنگآمیزی منفی
- ایمونومیکروسکوپ الکترونی
- اجسام انکلوزیون ویروسی
- شناسایی مبتنی بر مورفولوژی
Mechanisms
ایمونوفلورسانس از آنتیبادیهای نشاندار شده با رنگ فلورسنت بهره میبرد. در روش مستقیم، یک آنتیبادی نشاندار شده به آنتیژن ویروسی در سلولهای تثبیتشده متصل میشود و به صورت فلورسانس زیر میکروسکوپ دیده میشود؛ در روش غیرمستقیم، یک آنتیبادی اولیه بدون نشان به آنتیژن متصل میشود و سپس یک آنتیبادی ثانویه نشاندار شده به آنتیبادی اولیه متصل میشود و سیگنال را تقویت میکند. الگوی و محل فلورسانس نشان میدهد که کدام آنتیژنهای ویروسی وجود دارند و در کجا قرار دارند. میکروسکوپ الکترونی به جای آن ساختار را مستقیماً تصویربرداری میکند: رنگآمیزی منفی ذرات ویروسی را با یک رنگ الکترونتیره احاطه میکند تا شکل و اندازه آنها برجسته شود و امکان شناسایی مورفولوژیک خانوادههای ویروسی را فراهم آورد. ایمونومیکروسکوپ الکترونی ویژگی مبتنی بر آنتیبادی را به این مشاهده اضافه میکند. از آنجا که این روشها جزئیات فضایی را نشان میدهند، کیفیت آمادهسازی نمونه و ویژگی آنتیبادیها به شدت بر آنچه میتوان نتیجهگیری کرد تأثیر میگذارد.
Clinical relevance
ایمونوفلورسانس شناسایی و مکانیابی سریع مبتنی بر آنتیژن را در سلولها و بافتها فراهم میکند، و میکروسکوپ الکترونی راهی جامع برای شناسایی ذرات ویروسی بر اساس شکل ارائه میدهد که از نظر تاریخی برای شناسایی عوامل جدید یا غیرمنتظره مهم بوده است. این مدخل آنچه را که این روشهای مشاهده نشان میدهند و وابستگی آنها به کیفیت نمونه را توصیف میکند؛ این توصیف روششناختی است و مبنایی برای تصمیمگیریهای تشخیصی یا درمانی فردی نیست.
History
ایمونوفلورسانس توسط آلبرت کوونز و همکارانش پایهگذاری شد، که اصلاحات آنها در سال ۱۹۵۰ مکانیابی آنتیژنها با آنتیبادی فلورسنت را عملی ساخت و خانواده گستردهای از آزمایشهای تشخیصی را پایهریزی کرد. میکروسکوپ الکترونی با رنگآمیزی منفی، که توسط برنر و هورن در سال ۱۹۵۹ معرفی شد، راهی سریع برای ویروسشناسان برای مشاهده مورفولوژی ذرات ویروسی فراهم آورد و به کشف و شناسایی بسیاری از ویروسها قبل از اینکه شناسایی مولکولی رایج شود، کمک کرد.
Key figures
- Albert Coons
- Sydney Brenner
- Robert Horne
Related topics
Seminal works
- coons-kaplan-1950
- brenner-horne-1959
Frequently asked questions
- تفاوت بین ایمونوفلورسانس مستقیم و غیرمستقیم چیست؟
- در ایمونوفلورسانس مستقیم، یک آنتیبادی نشاندار شده با فلورسنت به آنتیژن ویروسی متصل میشود، در حالی که ایمونوفلورسانس غیرمستقیم از یک آنتیبادی اولیه بدون نشان و سپس یک آنتیبادی ثانویه نشاندار شده استفاده میکند که سیگنال را تقویت کرده و انعطافپذیری را با هزینه یک مرحله اضافی افزایش میدهد.
- چرا میکروسکوپ الکترونی با وجود روشهای مولکولی همچنان مفید باقی مانده است؟
- میکروسکوپ الکترونی میتواند ذرات ویروسی را بر اساس شکل مشخصه آنها بدون نیاز به دانستن قبلی اینکه به دنبال کدام ویروس بگردد، شناسایی کند، که آن را برای بررسی عوامل جدید یا غیرمنتظرهای که ممکن است آزمایشهای مولکولی هدفمند آنها را از دست بدهند، ارزشمند میسازد.