Kính hiển vi điện tử và cấu trúc siêu hiển vi

Kính hiển vi điện tử sử dụng chùm điện tử thay vì ánh sáng để tạo ảnh mô, đạt được độ phân giải cao hơn nhiều và tiết lộ cấu trúc tinh vi — các bào quan, màng và cách sắp xếp đại phân tử — được gọi chung là cấu trúc siêu hiển vi. Vì bước sóng của điện tử ngắn hơn nhiều so với ánh sáng nhìn thấy, kỹ thuật này có thể phân giải chi tiết tốt hơn nhiều so với giới hạn của kính hiển vi quang học.

Definition

Kính hiển vi điện tử là một kỹ thuật hiển vi tạo ra hình ảnh bằng cách sử dụng chùm điện tử để đạt được độ phân giải ở thang nanomet; cấu trúc siêu hiển vi đề cập đến các chi tiết tế bào và mô tinh vi — các bào quan và thành phần đại phân tử — được tiết lộ ở độ phân giải này.

Scope

Chủ đề này bao gồm lý do tại sao kính hiển vi điện tử đạt được độ phân giải cao, quá trình chuẩn bị mẫu vật chuyên biệt mà nó yêu cầu (cố định tinh vi, nhúng nhựa, cắt lát siêu mỏng, nhuộm kim loại nặng), và sự khác biệt giữa chế độ truyền qua và quét. Đây là một tài liệu tham khảo về phương pháp luận và không cung cấp hướng dẫn diễn giải lâm sàng.

Core questions

• Tại sao chùm điện tử có thể phân giải chi tiết tinh vi hơn nhiều so với ánh sáng nhìn thấy?
• Mô cần chuẩn bị chuyên biệt nào cho kính hiển vi điện tử?
• Kính hiển vi điện tử truyền qua và quét khác nhau như thế nào về những gì chúng hiển thị?
• Độ tương phản được tạo ra như thế nào trong một mẫu vật sinh học có độ tương phản thấp?

Key concepts

• Độ phân giải và bước sóng điện tử
• Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
• Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
• Cố định bằng Glutaraldehyde và Osmium
• Nhúng nhựa và cắt lát siêu mỏng
• Nhuộm kim loại nặng (uranyl, chì)
• Diễn giải cấu trúc siêu hiển vi

Mechanisms

Vì điện tử có bước sóng ngắn hơn nhiều so với ánh sáng nhìn thấy, một chùm điện tử có thể phân giải các cấu trúc xuống đến thang nanomet, vượt xa giới hạn nhiễu xạ của kính hiển vi quang học. Để chịu được chân không và chùm tia cũng như bảo tồn cấu trúc tinh vi, mô được cố định trong điều kiện khắt khe — thường là cố định bằng aldehyde sau đó là osmium tetroxide, dựa trên hóa học cố định bằng aldehyde được Sabatini và cộng sự mô tả (Sabatini, 1963) — sau đó được nhúng vào nhựa và cắt thành các lát siêu mỏng. Vật liệu sinh học tán xạ điện tử yếu, vì vậy độ tương phản được tăng cường bằng cách nhuộm bằng muối kim loại nặng; chì citrate ở pH cao đã trở thành một chất nhuộm cản điện tử tiêu chuẩn cho mục đích này (Reynolds, 1963). Trong kính hiển vi điện tử truyền qua, điện tử đi qua lát cắt mỏng để tạo thành hình ảnh cấu trúc bên trong, trong khi trong kính hiển vi điện tử quét, chùm điện tử được quét qua bề mặt mẫu vật và các tín hiệu được phát hiện sẽ tạo ra hình ảnh bề mặt có vẻ ba chiều. Các nguyên tắc và kỹ thuật được củng cố trong các tài liệu tham khảo tiêu chuẩn (Bozzola & Russell, 1999; Hayat, 2000).

Clinical relevance

Kiểm tra cấu trúc siêu hiển vi đóng góp vào nghiên cứu sinh học tế bào và một số lĩnh vực chọn lọc của bệnh lý học chẩn đoán nơi cấu trúc tinh vi cung cấp thông tin. Mục này giải thích các phương pháp về mặt khái niệm; nó mô tả cách tạo ra hình ảnh cấu trúc siêu hiển vi và không phải là cơ sở cho các quyết định chẩn đoán hoặc điều trị cá nhân.

Evidence & guidelines

Việc chuẩn bị mẫu vật và tạo ảnh bằng kính hiển vi điện tử được củng cố trong các tài liệu tham khảo phương pháp đã được thiết lập (Bozzola & Russell, 1999; Hayat, 2000), dựa trên công trình cơ bản về cố định bằng aldehyde (Sabatini, 1963) và nhuộm kim loại nặng (Reynolds, 1963).

History

Kính hiển vi điện tử được phát triển vào những năm 1930 và được áp dụng cho mô sinh học trong suốt giữa thế kỷ XX, một khi các phương pháp chuẩn bị có thể bảo tồn cấu trúc tinh vi. Cố định bằng aldehyde được mô tả để bảo tồn cấu trúc siêu hiển vi (Sabatini, 1963), và nhuộm kim loại nặng tiêu chuẩn như chì citrate của Reynolds (Reynolds, 1963) đã tạo ra độ tương phản cần thiết để diễn giải cấu trúc siêu hiển vi tế bào, biến kính hiển vi điện tử thành nền tảng của sinh học tế bào hiện đại.

Key figures

• David Sabatini
• Edward Reynolds

Seminal works

• sabatini-1963
• reynolds-1963

Frequently asked questions

Tại sao kính hiển vi điện tử phân giải chi tiết hơn kính hiển vi quang học?

Độ phân giải bị giới hạn bởi bước sóng của bức xạ hình ảnh; điện tử có bước sóng ngắn hơn nhiều so với ánh sáng nhìn thấy, vì vậy chùm điện tử có thể phân biệt các cấu trúc nhỏ hơn nhiều so với kính hiển vi quang học.

Sự khác biệt giữa kính hiển vi điện tử truyền qua và quét là gì?

Kính hiển vi điện tử truyền qua cho điện tử đi qua một lát cắt siêu mỏng để tạo ảnh cấu trúc bên trong, trong khi kính hiển vi điện tử quét quét một chùm điện tử qua bề mặt mẫu vật và phát hiện các tín hiệu phát ra để tạo ảnh địa hình bề mặt.