Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, uçucu olmayan ve termal olarak dayanıksız bileşikleri, yüksek basınç altında ince dolgu maddesi içeren bir kolondan sıvı bir hareketli faz pompalanmasıyla ayırmaktadır.
Tanım
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, yüksek basınç altında ince sabit faz partikülleri içeren bir kolondan sıvı bir hareketli fazın zorla geçirilmesiyle, analitleri iki fazla farklı etkileşimlerine göre ayıran bir ayırma tekniğidir.
Kapsam
Bu konu, sıvı kromatografisini yüksek performanslı haliyle ele almaktadır: pompalar ve gradyan sistemleri, küçük gözenekli partiküllerle doldurulmuş kolonlar, başlıca ayırma modları—ters faz, normal faz, iyon değişimi ve boyut dışlama—ile ultraviyole, diyot dizisi, floresans ve kütle spektrometrik dedektörleri dahil olmak üzere çeşitli dedektörler. Ayrıca, metot geliştirme, hareketli faz bileşiminin seçicilikteki rolü ve pik alanlarından kantitasyon konularını da kapsamaktadır.
Temel sorular
- Ters faz ve iyon değişimi gibi ayırma modları, tutunma mekanizmalarında nasıl farklılık göstermektedir?
- Gradyan elüsyonu dahil olmak üzere hareketli faz bileşimi, seçiciliği ve çalışma süresini nasıl kontrol etmektedir?
- Daha küçük sabit faz partikülleri verimliliği neden artırmaktadır ve bunun maliyeti nedir?
- HPLC dedektörleri hassasiyet, seçicilik ve tanımlama için nasıl seçilmektedir?
Temel kuramlar
- Ters fazda tutunma
- Baskın ters faz modunda, apolar bir sabit faz, polar bir sulu-organik hareketli fazdan analitleri hidrofobisite oranlarına göre tutmaktadır; organik fraksiyonu artırmak tutunmayı azaltarak, organik bileşiklerin ayarlanabilir ve geniş ölçüde uygulanabilir bir ayrımını sağlamaktadır.
Mekanizmalar
Yüksek basınçlı bir pompa, bağlı bir sabit faz taşıyan gözenekli partiküllerle doldurulmuş bir kolondan sıvı bir hareketli fazı itmektedir. Akışa enjekte edilen bir numune, her bir analitin kimyasına göre hareketli ve sabit fazlar arasında dağılmasıyla ayrılmaktadır; çalışma sırasında hareketli faz bileşimini değiştirmek, yani gradyan elüsyonu, ayırmayı keskinleştirmekte ve hızlandırmaktadır. Elüe olan analitler, pik alanları kalibrasyon standartlarına göre kantitasyonlarını sağlayan bir dedektörden geçmektedir.
Klinik önem
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, farmasötik analiz ve safsızlık profillemesi, terapötik ilaç ve metabolit ölçümü, gıda ve doğal ürün analizi ile biyomolekül karakterizasyonu için baskın bir yöntem olup, sıvı kromatografisi–kütle spektrometrisi için önde gelen bir ön uç olarak kullanılmaktadır.
Tarihçe
Modern sıvı kromatografisi, pompaların, ince partikül dolgularının ve hassas dedektörlerin yüksek basınç altında sıvı ayırmalarına olanak sağlamasıyla 1960'ların sonları ve 1970'lerde ortaya çıkmıştır. Bağlı silika içeren ters faz kolonları, en çok kullanılan mod haline gelmiş ve daha sonra iki mikrometrenin altındaki partiküllere geçiş, daha hızlı ve daha verimli ayırmalar sağlayan ultra yüksek performanslı sistemlerin ortaya çıkmasına neden olmuştur.
Öne çıkan isimler
- Lloyd Snyder
- Joseph Jack Kirkland
- Csaba Horváth
İlgili konular
Temel eserler
- snyder2010
- skoog2017
Sıkça sorulan sorular
- Ters faz kromatografisi nedir?
- En yaygın HPLC modu olup, apolar bir sabit faz ve polar bir hareketli faz kullanır; bu nedenle daha hidrofobik analitler daha uzun süre tutulmaktadır. Çok çeşitli organik ve biyoorganik bileşikler için oldukça uygundur.
- HPLC, gaz kromatografisinden nasıl farklılık göstermektedir?
- HPLC, sıvı bir hareketli faz kullanır ve oda sıcaklığına yakın sıcaklıklarda çalışmaktadır; bu sayede gaz kromatografisi ile analiz edilemeyen uçucu olmayan, polar ve termal olarak hassas bileşikleri işleyebilmektedir.