Espectroscopia de Fluorescência Molecular

A espectroscopia de fluorescência molecular mede a luz emitida por moléculas após absorverem radiação, proporcionando quantificação altamente sensível e seletiva.

Definition

A espectroscopia de fluorescência molecular é um método analítico baseado em luminescência que quantifica analitos a partir da intensidade da luz que emitem ao retornar de um estado eletrônico excitado para o estado fundamental.

Scope

Este tópico abrange os métodos de fotoluminescência utilizados em análises — principalmente fluorescência, com fosforescência e quimioluminescência relacionadas. Ele trata do processo de excitação e emissão, da instrumentação de um espectrofluorímetro com seus seletores separados de comprimento de onda de excitação e emissão, dos fatores que governam a intensidade da fluorescência e o rendimento quântico, e dos efeitos de supressão (quenching) e de filtro interno que complicam a quantificação.

Core questions

• Como a absorção e a emissão se combinam para produzir um sinal de fluorescência, e por que ele é tão sensível?
• Quais características moleculares tornam um composto fortemente fluorescente?
• Como os efeitos de supressão (quenching) e de filtro interno distorcem as medições de fluorescência?
• Quando a fluorescência é preferível à absorção para análise de traços?

Key theories

Excitação e emissão com deslocamento de Stokes

Uma molécula absorve um fóton para atingir um estado singleto excitado, perde energia não radiativamente para o nível vibracional mais baixo e, em seguida, emite um fóton de comprimento de onda mais longo; este deslocamento de Stokes separa a emissão da excitação e fundamenta a sensibilidade e seletividade da fluorescência, representada de forma compacta pelo diagrama de Jablonski.

Mechanisms

A absorção de luz ultravioleta ou visível eleva uma molécula a um estado singleto excitado. O relaxamento vibracional a leva ao nível excitado mais baixo, do qual ela pode emitir um fóton de fluorescência de energia mais baixa. Como a emissão é medida contra um fundo quase escuro, em vez de como uma pequena mudança em um grande sinal transmitido, a fluorescência pode atingir limites de detecção muito mais baixos do que a absorção. A intensidade é proporcional à concentração em baixa absorbância, mas é reduzida por supressão (quenching) e por absorção de filtro interno em concentrações mais altas.

Clinical relevance

Os métodos de fluorescência são centrais para a bioanálise e o diagnóstico clínico, incluindo imunoensaios, quantificação de ácidos nucleicos e detecção de sequenciamento, citometria de fluxo e análise de traços ambientais, devido à sua alta sensibilidade e à disponibilidade de marcadores fluorescentes seletivos.

History

George Stokes descreveu e nomeou a fluorescência em meados do século XIX, observando o deslocamento característico para comprimentos de onda mais longos. A representação dos níveis de energia organizada por Jabłoński na década de 1930 esclareceu as vias radiativas e não radiativas concorrentes, e o desenvolvimento de espectrofluorímetros sensíveis baseados em fotomultiplicadores estabeleceu a fluorescência como uma técnica líder de análise de traços.

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

Por que a fluorescência é geralmente mais sensível que a absorção?

A fluorescência é medida como luz emitida contra um fundo escuro, de modo que mesmo um sinal fraco se destaca, enquanto a absorção requer a detecção de uma pequena diminuição em um grande feixe transmitido, o que limita a concentração mínima que pode ser medida.

O que é o efeito de filtro interno?

Em maior absorbância do analito ou da matriz, parte da luz excitante e parte da luz emitida são reabsorvidas antes de atingir o detector, de modo que a intensidade da fluorescência não aumenta mais linearmente com a concentração e pode até diminuir.