クライオ電子顕微鏡

急速凍結した生体分子を電子で画像化し、多数のノイズの多い投影画像を組み合わせて、結晶化を必要とせずに三次元構造を再構築する手法です。

Definition

クライオ電子顕微鏡法は、急速凍結した試料を電子で画像化し、多数の投影画像から三次元密度を再構築することによって、生体分子の構造を決定する手法です。

Scope

このトピックでは、構造決定法としてのクライオ電子顕微鏡について扱います。具体的には、試料のガラス化、透過型電子顕微鏡を用いた単粒子イメージング、および多数の二次元投影画像からの三次元密度計算による再構築について説明します。また、直接電子検出器がいかに達成可能な分解能を変革したか、そしてクライオEMが特に大型で柔軟な複合体に対して、どのように結晶学を補完するのかについても解説します。

Core questions

• 試料はなぜ急速にガラス状氷に凍結されるのでしょうか？
• 二次元画像から三次元構造はどのように再構築されるのでしょうか？
• 直接電子検出器はなぜ分解能を劇的に向上させたのでしょうか？
• クライオEMはどのような種類の分子に特に適しているのでしょうか？

Key theories

単粒子再構築

ランダムな配向で凍結された同一粒子のノイズの多い多数の画像を分類、整列、結合することで、三次元密度を再構築します。これにより、個々の低線量画像に存在するノイズが平均化されて除去されます。

検出器による分解能の限界

放射線損傷により電子線量が低く抑えられるため、長らく画像品質がクライオEMの限界となっていました。高感度でフレームごとの運動補正が可能な直接電子検出器は、この限界を取り除き、ほぼ原子分解能を可能にしました。

Mechanisms

薄い試料層を極低温冷却剤に急速に投入することで、水が有害な結晶を形成するのではなくガラス化し、分子をほぼ天然の状態に保ちます。顕微鏡内では、電子が試料を通過して投影画像を形成しますが、放射線損傷を抑えるため線量は低く保たれるため、個々の画像は非常にノイズが多くなります。ソフトウェアは粒子画像を分類し、各粒子の配向を推定し、数千から数百万の画像を組み合わせて三次元密度を構築し、その中に原子モデルを構築することができます。高感度な直接検出器が動画を記録し、ビーム誘起運動を補正する機能は、高分解能達成の鍵となりました。

Clinical relevance

クライオEMは現在、主要な薬剤標的である大型複合体や膜タンパク質の構造を提供し、構造に基づいた研究を支援しています。本手法は教育的背景として提示されており、臨床的ガイダンスを意図するものではありません。

History

デュボシェによるガラス化、フランクによる単粒子再構築法、ヘンダーソンによる原子分解能の追求が基礎を築き、ノーベル賞によってその功績が認められました。2013年頃に登場した直接電子検出器は、分解能の革命をもたらし、クライオEMを主流の構造解析法としました。

Key figures

• Richard Henderson
• Joachim Frank
• Jacques Dubochet
• Werner Kühlbrandt

Seminal works

• kuhlbrandt2014
• phillips2012

Frequently asked questions

クライオEMはなぜ結晶を必要としないのですか？

個々の粒子を多数直接画像化し、計算によって平均化するため、X線結晶構造解析でしばしば困難な結晶化のステップを回避できます。

試料はなぜそれほど低温に保たれなければならないのですか？

急速な凍結により、分子はガラス状（ガラスのような）氷の中に固定され、その構造が保存され、画像化中の放射線損傷が抑制されます。これにより、通常の氷晶が形成されて分子を歪ませるのを防ぎます。