共焦点顕微鏡と蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡は、蛍光分子を励起し、それらが放出する長波長の光を収集することで標本を画像化し、細胞の高コントラストで分子特異的な画像を提供します。共焦点顕微鏡は、焦点外の光を排除するピンホールを追加することで、シャープな光学的切片を生成し、これらを組み合わせて細胞の三次元像を構築することができます。

Definition

蛍光顕微鏡は、蛍光色素による光の吸収と再放出を利用して標識された構造を画像化します。共焦点顕微鏡は、ピンホールが焦点外の光を排除し、薄い焦点面のみが各画像に寄与するようにする蛍光技術であり、光学的切片を生成します。

Scope

本項目では、蛍光コントラストの原理、共焦点イメージングの光学的切片化の利点、および回折限界以下で蛍光イメージングを可能にする広範な超解像法について扱います。これらは細胞生物学におけるイメージング手法として扱われ、臨床的な指示としては扱われません。

Core questions

• 蛍光は細胞内でどのように分子コントラストを提供しますか？
• 共焦点ピンホールはどのように光学的切片を生成しますか？
• 細胞の三次元画像はどのように再構築されますか？
• 超解像法はどのように回折限界を超えますか？

Key concepts

• 蛍光励起と発光
• 蛍光色素と蛍光タンパク質
• 共焦点ピンホールと光学的切片化
• 三次元再構築
• 光退色と光毒性
• 超解像（回折限界を超えた）イメージング

Mechanisms

蛍光顕微鏡では、蛍光色素が励起光を吸収し、より長波長の光を再放出します。この光はフィルターによって励起光から分離され、暗い背景に対して明るく特異的なコントラストを与えます（LichtmanとConchelloによる総説を参照）。しかし、従来の蛍光画像には、焦点面の上方および下方からのぼやけた光が含まれます。共焦点顕微鏡は、焦点に共役なピンホールを配置することで、焦点外の光を排除し、ConchelloとLichtmanによって記述された光学的切片を生成します。これらの切片は三次元に積み重ねることができます。発光は、すべての光学顕微鏡と同様に、依然として回折限界の制約を受けるため、HellとWichmannによって導入された誘導放出抑制顕微鏡（stimulated-emission-depletion microscopy）などの超解像アプローチは、蛍光プロセス自体を操作することで、その限界をはるかに下回る詳細を解像します（Schermellehらによる調査を参照）。

Clinical relevance

共焦点顕微鏡と蛍光顕微鏡は、分子の局在化や組織の三次元画像化のために、病理学、眼科学、生物医学研究で広く使用されています。本項目は、関連するイメージング原理を説明するものであり、個々の診断や治療の決定の根拠となるものではなく、参考教育的なものです。

History

共焦点の原理は1950年代にMarvin Minskyによって考案されましたが、実用的なレーザースキャン共焦点顕微鏡と明るい合成および遺伝子コード化された蛍光色素の登場により、20世紀後半から蛍光イメージングは細胞生物学において支配的なものとなりました。その後、誘導放出抑制顕微鏡（Hell & Wichmann, 1994）および関連技術による回折限界の打破は、Schermellehらがまとめた超解像蛍光イメージングの時代を切り開きました。

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

共焦点ピンホールは何をしますか？

焦点面外からの光が遮断され、焦点内の光のみが画像形成に寄与するように配置されます。これにより、薄い光学的切片が生成され、他の切片と組み合わせて三次元像を形成することができます。

蛍光顕微鏡はどのように回折限界を超えることができますか？

誘導放出抑制顕微鏡などの超解像法は、蛍光発光プロセスを制御することで、従来の回折限界をはるかに下回る詳細を解像することができます。