आरएनए अनुक्रमण विधियाँ और प्रौद्योगिकियाँ

आरएनए अनुक्रमण (RNA-seq) आरएनए को एक अनुक्रमण लाइब्रेरी में परिवर्तित करके और परिणामी रीड्स की गणना करके ट्रांसक्रिप्टोम को मापता है जो जीनों और ट्रांसक्रिप्ट्स पर वापस मैप होते हैं। पूर्वनिर्धारित प्रोब के साथ हाइब्रिडाइज करने के बजाय सीधे ट्रांसक्रिप्ट्स का नमूना लेकर, आरएनए-सेक एक विस्तृत गतिशील रेंज में अभिव्यक्ति को निर्धारित कर सकता है, पहले से अज्ञात ट्रांसक्रिप्ट्स और स्प्लिस जंक्शनों की खोज कर सकता है, और आइसोफॉर्म संरचना को हल कर सकता है।

Definition

आरएनए अनुक्रमण एक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण है जिसमें आरएनए को रिवर्स-ट्रांसक्राइब्ड (या सीधे अनुक्रमित) किया जाता है और परिणामी रीड्स को ट्रांसक्रिप्ट बहुतायत को निर्धारित करने और ट्रांसक्रिप्टोम में ट्रांसक्रिप्ट संरचना को चिह्नित करने के लिए मैप और गिना जाता है।

Scope

यह विषय आरएनए-सेक के प्रायोगिक और कम्प्यूटेशनल कार्यप्रवाह को शामिल करता है: आरएनए चयन और लाइब्रेरी तैयारी, लघु-रीड और दीर्घ-रीड अनुक्रमण रसायन विज्ञान, रीड संरेखण या छद्म-संरेखण, और अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण और सामान्यीकरण। यह ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के भीतर एक पद्धतिगत संदर्भ है और नैदानिक मार्गदर्शन प्रदान नहीं करता है।

Core questions

• आरएनए नमूने को अनुक्रमण लाइब्रेरी में कैसे बदला जाता है, और कौन से चयन चरण (पॉली-ए या राइबोसोमल क्षय) मापे गए को आकार देते हैं?
• रीड्स को संदर्भ में कैसे संरेखित या छद्म-संरेखित किया जाता है, और प्रति जीन या ट्रांसक्रिप्ट कैसे निर्धारित किया जाता है?
• सामान्यीकरण कैसे किया जाता है ताकि नमूनों में अभिव्यक्ति की तुलना की जा सके?
• दीर्घ-रीड और प्रत्यक्ष-आरएनए प्रौद्योगिकियां लघु-रीड अनुक्रमण पर क्या जोड़ती हैं?

Key concepts

• लाइब्रेरी तैयारी और पॉली-ए चयन या आरआरएनए क्षय
• लघु-रीड बनाम दीर्घ-रीड अनुक्रमण
• रीड संरेखण और छद्म-संरेखण
• रीड गणना और परिमाणीकरण
• सामान्यीकरण (उदाहरण के लिए, FPKM/TPM जैसी इकाइयाँ)
• अनुक्रमण गहराई और कवरेज
• स्प्लिस-जंक्शन का पता लगाना
• प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण

Mechanisms

एक विशिष्ट कार्यप्रवाह में, आरएनए निकाला जाता है और एक उपसमूह का चयन किया जाता है (आमतौर पर पॉली-एडेनिलेटेड मैसेंजर आरएनए, या राइबोसोमल आरएनए क्षय के बाद कुल आरएनए), खंडित किया जाता है, पूरक डीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब्ड किया जाता है, और एक एडाप्टर-लिगेटेड लाइब्रेरी में बनाया जाता है। लाइब्रेरी को लाखों रीड्स उत्पन्न करने के लिए अनुक्रमित किया जाता है, जिन्हें एक संदर्भ जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम के साथ संरेखित किया जाता है, या संरेखण-मुक्त छद्म-संरेखण द्वारा निर्धारित किया जाता है। प्रत्येक विशेषता को ओवरलैप करने वाले रीड्स गिने जाते हैं; क्योंकि लंबे ट्रांसक्रिप्ट्स और अधिक गहराई से अनुक्रमित नमूने अधिक रीड्स जमा करते हैं, बहुतायत की तुलना करने से पहले ट्रांसक्रिप्ट लंबाई और लाइब्रेरी आकार के लिए गणना को सामान्यीकृत किया जाता है। मोर्टाज़ावी और सहयोगियों ने कोर काउंटिंग-और-सामान्यीकरण ढांचे की शुरुआत की, और वांग और ओज़सोलाक द्वारा समीक्षाओं ने प्लेटफॉर्म की ताकत और सीमाओं को निर्धारित किया। दीर्घ-रीड और प्रत्यक्ष-आरएनए प्रौद्योगिकियां पूर्ण-लंबाई वाले अणुओं को अनुक्रमित करती हैं, उच्च प्रति-रीड त्रुटि और कम थ्रूपुट की लागत पर आइसोफॉर्म रिज़ॉल्यूशन में सुधार करती हैं।

Clinical relevance

आरएनए-सेक अनुसंधान और अनुवादकीय जीनोमिक्स में अधिकांश आणविक-वर्गीकरण और बायोमार्कर-खोज साक्ष्य उत्पन्न करता है, और तेजी से नैदानिक ट्रांसक्रिप्ट और संलयन का पता लगाने का समर्थन करता है। एक संदर्भ विषय के रूप में यह बताता है कि ट्रांसक्रिप्टोमिक साक्ष्य कैसे उत्पन्न होता है; यह व्यक्तिगत नैदानिक या उपचार निर्णयों का आधार नहीं है।

Evidence & guidelines

आरएनए-सेक के लिए सर्वोत्तम-अभ्यास ढांचे मोर्टाज़ावी और सहयोगियों के मूलभूत परिमाणीकरण कार्य और विधि समीक्षाओं (वांग और सहयोगी; ओज़सोलाक और मिलोस) से प्राप्त होते हैं। अमरसिंघे और सहयोगियों द्वारा सर्वेक्षण किए गए दीर्घ-रीड विश्लेषण में अपनी स्वयं की विचारणाएँ शामिल हैं। ये नैदानिक अभ्यास दिशानिर्देशों के बजाय पद्धतिगत संदर्भ हैं।

History

आरएनए-सेक 2008 में उच्च-थ्रूपुट लघु-रीड अनुक्रमण को रिवर्स-ट्रांसक्राइब्ड आरएनए पर लागू किए जाने के रूप में उभरा, जिसमें मोर्टाज़ावी और सहयोगियों ने रीड गणना से स्तनधारी ट्रांसक्रिप्टोम को मैप और निर्धारित करने का तरीका स्थापित किया। अगले वर्षों में समीक्षाओं ने लाइब्रेरी-तैयारी और विश्लेषण मानकों को समेकित किया, और 2010 के दशक के मध्य से दीर्घ-रीड और प्रत्यक्ष-आरएनए प्लेटफॉर्म ने पूर्ण-लंबाई वाले आइसोफॉर्म अनुक्रमण की ओर दृष्टिकोण का विस्तार किया।

Debates

लघु-रीड बनाम दीर्घ-रीड अनुक्रमण

लघु रीड्स उच्च थ्रूपुट और कम प्रति-बेस त्रुटि प्रदान करते हैं लेकिन आइसोफॉर्म को केवल अप्रत्यक्ष रूप से पुनर्निर्मित करते हैं, जबकि दीर्घ रीड्स पूर्ण-लंबाई वाले ट्रांसक्रिप्ट्स को अनुक्रमित करते हैं और उच्च त्रुटि दरों और कम गहराई की लागत पर आइसोफॉर्म को सीधे हल करते हैं; उचित विकल्प इस बात पर निर्भर करता है कि सटीक परिमाणीकरण या आइसोफॉर्म संरचना प्राथमिकता है।

Key figures

• Barbara Wold
• Ali Mortazavi
• Michael Snyder

Seminal works

• mortazavi-2008
• wang-2009
• ozsolak-2011

Frequently asked questions

पॉली-ए चयन और राइबोसोमल आरएनए क्षय के बीच क्या अंतर है?

पॉली-ए चयन पॉलीएडेनिलेटेड मैसेंजर आरएनए को कैप्चर करता है और प्रोटीन-कोडिंग ट्रांसक्रिप्ट्स के लिए कुशल है, जबकि राइबोसोमल आरएनए क्षय प्रचुर आरआरएनए को हटाता है जबकि गैर-पॉलीएडेनिलेटेड और डिग्रेडेड ट्रांसक्रिप्ट्स को बरकरार रखता है। चुनाव यह निर्धारित करता है कि प्रयोग कौन सी आरएनए प्रजातियों को माप सकता है।

तुलना से पहले आरएनए-सेक गणनाओं को सामान्यीकृत क्यों किया जाता है?

कच्ची रीड गणना ट्रांसक्रिप्ट लंबाई और प्रत्येक नमूने को कितनी गहराई से अनुक्रमित किया गया था, इस पर निर्भर करती है, इसलिए उनकी सीधे तुलना नहीं की जा सकती है। सामान्यीकरण इन कारकों के लिए समायोजित करता है ताकि बहुतायत में अंतर तकनीकी गहराई या लंबाई के बजाय जीव विज्ञान को दर्शाए।