Cromatografía líquida de alta resolución

La cromatografía líquida de alta resolución separa compuestos no volátiles y térmicamente lábiles bombeando una fase móvil líquida a través de una columna de empaquetamiento fino a alta presión.

Definition

La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica de separación en la que una fase móvil líquida es forzada a alta presión a través de una columna de finas partículas de fase estacionaria, separando los analitos por su interacción diferencial con las dos fases.

Scope

Este tema abarca la cromatografía líquida en su forma de alta resolución: bombas y sistemas de gradiente, columnas empaquetadas con pequeñas partículas porosas, los principales modos de separación —fase inversa, fase normal, intercambio iónico y exclusión por tamaño— y detectores que incluyen ultravioleta, de matriz de diodos, de fluorescencia y espectrometría de masas. Aborda el desarrollo de métodos, el papel de la composición de la fase móvil en la selectividad y la cuantificación a partir de las áreas de los picos.

Core questions

• ¿Cómo difieren los modos de separación, como la fase inversa y el intercambio iónico, en su mecanismo de retención?
• ¿Cómo controla la composición de la fase móvil, incluida la elución por gradiente, la selectividad y el tiempo de corrida?
• ¿Por qué las partículas más pequeñas de la fase estacionaria mejoran la eficiencia y a qué costo?
• ¿Cómo se eligen los detectores de HPLC para la sensibilidad, la selectividad y la identificación?

Key theories

Retención en fase inversa

En el modo dominante de fase inversa, una fase estacionaria no polar retiene los analitos en proporción a su hidrofobicidad de una fase móvil acuosa-orgánica polar; el aumento de la fracción orgánica reduce la retención, lo que proporciona una separación sintonizable y ampliamente aplicable de compuestos orgánicos.

Mechanisms

Una bomba de alta presión impulsa una fase móvil líquida a través de una columna empaquetada con partículas porosas que llevan una fase estacionaria unida. Una muestra inyectada en el flujo se separa a medida que cada analito se distribuye entre las fases móvil y estacionaria según su química; cambiar la composición de la fase móvil durante la corrida, la elución por gradiente, agudiza y acelera la separación. Los analitos eluidos pasan a través de un detector cuyas áreas de pico los cuantifican frente a los estándares de calibración.

Clinical relevance

La cromatografía líquida de alta resolución es el método dominante para el ensayo farmacéutico y la elaboración de perfiles de impurezas, la medición de fármacos terapéuticos y metabolitos, el análisis de alimentos y productos naturales, y la caracterización de biomoléculas, y es el principal sistema de entrada para la cromatografía líquida-espectrometría de masas.

History

La cromatografía líquida moderna surgió a finales de los años 60 y 70, a medida que las bombas, los empaquetamientos de partículas finas y los detectores sensibles permitieron las separaciones líquidas a alta presión. Las columnas de fase inversa con sílice unida se convirtieron en el modo de trabajo principal, y el posterior paso a partículas de menos de dos micrómetros produjo sistemas de ultra alta resolución con separaciones más rápidas y eficientes.

Key figures

• Lloyd Snyder
• Joseph Jack Kirkland
• Csaba Horváth

Seminal works

• snyder2010
• skoog2017

Frequently asked questions

¿Qué es la cromatografía de fase inversa?

Es el modo de HPLC más común, que utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar, por lo que los analitos más hidrofóbicos se retienen durante más tiempo; es adecuada para una amplia gama de compuestos orgánicos y bioorgánicos.

¿En qué se diferencia la HPLC de la cromatografía de gases?

La HPLC utiliza una fase móvil líquida y funciona a temperaturas cercanas a la ambiente, por lo que maneja compuestos no volátiles, polares y térmicamente frágiles que no pueden analizarse mediante cromatografía de gases.