Kryo-Elektronenmikroskopie

Abbildung von schockgefrorenen Biomolekülen mit Elektronen und Kombination vieler verrauschter Projektionen zu einer dreidimensionalen Struktur, ohne die Notwendigkeit von Kristallen.

Definition

Die Kryo-Elektronenmikroskopie ist die Bestimmung der biomolekularen Struktur durch Abbildung schnell gefrorener Proben mit Elektronen und die Rekonstruktion einer dreidimensionalen Dichte aus vielen Projektionsbildern.

Scope

Dieses Thema behandelt die Kryo-Elektronenmikroskopie als Methode zur Strukturbestimmung: die Vitrifizierung der Probe, die Abbildung einzelner Partikel mit einem Transmissionselektronenmikroskop und die computergestützte Rekonstruktion einer dreidimensionalen Dichte aus vielen zweidimensionalen Projektionen. Es wird erläutert, warum Direktelektronendetektoren die erreichbare Auflösung verändert haben und wie die Kryo-EM die Kristallographie ergänzt, insbesondere bei großen und flexiblen Anordnungen.

Core questions

• Warum wird die Probe schnell zu glasartigem Eis gefroren?
• Wie werden dreidimensionale Strukturen aus zweidimensionalen Bildern rekonstruiert?
• Warum haben Direktelektronendetektoren die Auflösung so dramatisch verbessert?
• Für welche Arten von Molekülen ist die Kryo-EM besonders geeignet?

Key theories

Einzelpartikelrekonstruktion

Viele verrauschte Bilder identischer Partikel, die in zufälligen Orientierungen eingefroren sind, werden klassifiziert, ausgerichtet und kombiniert, um eine dreidimensionale Dichte zu rekonstruieren, wobei das Rauschen, das jedes einzelne Bild mit niedriger Dosis begrenzt, gemittelt wird.

Detektorlimitierte Auflösung

Da Strahlenschäden niedrige Elektronendosen erzwingen, begrenzte die Bildqualität lange Zeit die Kryo-EM; Direktelektronendetektoren mit hoher Empfindlichkeit und Bild-für-Bild-Bewegungskorrektur hoben diese Grenze auf und ermöglichten eine nahezu atomare Auflösung.

Mechanisms

Eine dünne Probenschicht wird so schnell in ein Kryogen getaucht, dass das Wasser vitrifiziert, anstatt schädigende Kristalle zu bilden, wodurch die Moleküle in einem nahezu nativen Zustand erhalten bleiben. Im Mikroskop passieren Elektronen die Probe und bilden Projektionsbilder, aber um Strahlenschäden zu begrenzen, wird die Dosis niedrig gehalten, sodass jedes Bild sehr verrauscht ist. Eine Software sortiert die Partikelbilder, schätzt die Orientierung jedes Partikels und kombiniert Tausende bis Millionen davon zu einer dreidimensionalen Dichte, in die ein atomares Modell eingebaut werden kann. Empfindliche Direktdetektoren, die Filme aufzeichnen und strahlungsinduzierte Bewegungen korrigieren, waren entscheidend für das Erreichen einer hohen Auflösung.

Clinical relevance

Die Kryo-EM liefert heute Strukturen großer Komplexe und Membranproteine, die wichtige Zielmoleküle für Medikamente sind, und unterstützt die strukturbasierte Forschung; die Methode wird als Bildungshintergrund und nicht als klinische Leitlinie dargestellt.

History

Dubochets Vitrifizierung, Franks Methoden zur Einzelpartikelrekonstruktion und Hendersons Streben nach atomarer Auflösung legten den Grundstein, der mit einem Nobelpreis gewürdigt wurde; die Einführung von Direktelektronendetektoren um 2013 führte zu der Auflösungsrevolution, die die Kryo-EM zu einer etablierten Strukturmethode machte.

Key figures

• Richard Henderson
• Joachim Frank
• Jacques Dubochet
• Werner Kühlbrandt

Seminal works

• kuhlbrandt2014
• phillips2012

Frequently asked questions

Warum benötigt die Kryo-EM keine Kristalle?

Sie bildet viele einzelne Partikel direkt ab und mittelt sie rechnerisch, wodurch der oft schwierige Kristallisationsschritt, der bei der Röntgenkristallographie erforderlich ist, vermieden wird.

Warum muss die Probe so kalt gehalten werden?

Schnelles Einfrieren fixiert die Moleküle in glasartigem (vitreous) Eis, das ihre Struktur bewahrt und Strahlenschäden während der Abbildung begrenzt, anstatt dass sich gewöhnliche Eiskristalle bilden und sie verzerren.