分子荧光光谱法
分子荧光光谱法测量分子吸收辐射后发出的光，提供高灵敏度和高选择性的定量分析。
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Definition
分子荧光光谱法是一种基于发光的分析方法，通过测量分析物从激发电子态返回基态时发出的光强度来对其进行定量。
Scope
本主题涵盖分析中使用的光致发光方法——主要是荧光，以及相关的磷光和化学发光。它涉及激发和发射过程、分光荧光计的仪器及其独立的激发和发射波长选择器、控制荧光强度和量子产率的因素，以及使定量复杂化的猝灭和内滤效应。
Core questions
- 吸收和发射如何结合产生荧光信号，以及为何它如此灵敏？
- 哪些分子特征使化合物具有强荧光性？
- 猝灭和内滤效应如何扭曲荧光测量？
- 在痕量分析中，何时荧光法优于吸收法？
Key theories
- 激发和发射与斯托克斯位移
- 分子吸收光子达到激发单线态，非辐射地损失能量至最低振动能级，然后发射波长更长的光子；这种斯托克斯位移将发射与激发分离，并构成了荧光灵敏度和选择性的基础，由贾布隆斯基图（Jablonski diagram）简洁地描绘。
Mechanisms
紫外或可见光的吸收将分子提升到激发单线态。振动弛豫使其达到最低激发能级，从该能级可以发射能量较低的荧光光子。由于发射是在近乎黑暗的背景下测量的，而不是作为大的透射信号中的微小变化，因此荧光可以达到比吸收法低得多的检测限。在低吸光度下，强度与浓度成正比，但在较高浓度下，由于猝灭和内滤吸收而降低。
Clinical relevance
荧光方法是生物分析和临床诊断的核心，包括免疫分析、核酸定量和测序检测、流式细胞术以及环境痕量分析，这得益于其高灵敏度和选择性荧光标记物的可用性。
History
乔治·斯托克斯（George Stokes）在19世纪中叶描述并命名了荧光，观察到其特征性的向长波长移动。20世纪30年代，贾布隆斯基（Jabłoński）组织的能级图阐明了竞争性的辐射和非辐射途径，而基于灵敏光电倍增管的分光荧光计的发展使荧光成为一种领先的痕量分析技术。
Key figures
- George Gabriel Stokes
- Aleksander Jabłoński
- Joseph R. Lakowicz
Related topics
Seminal works
- lakowicz2006
- skoog2017
Frequently asked questions
- 为什么荧光通常比吸收更灵敏？
- 荧光是作为在黑暗背景下发出的光来测量的，因此即使是微弱的信号也能突出显示，而吸收则需要检测大透射光束中的微小下降，这限制了可测量的最低浓度。
- 什么是内滤效应？
- 在较高分析物或基质吸光度下，部分激发光和部分发射光在到达检测器之前被重新吸收，因此荧光强度不再随浓度线性增加，甚至可能下降。