Kính hiển vi đồng tiêu và huỳnh quang

Kính hiển vi huỳnh quang chụp ảnh mẫu vật bằng cách kích thích các phân tử huỳnh quang và thu thập ánh sáng có bước sóng dài hơn mà chúng phát ra, tạo ra hình ảnh tế bào có độ tương phản cao, đặc trưng ở cấp độ phân tử. Kính hiển vi đồng tiêu bổ sung một lỗ kim loại loại bỏ ánh sáng ngoài tiêu điểm, tạo ra các lát cắt quang học sắc nét có thể được lắp ráp thành các hình ảnh ba chiều của tế bào.

Definition

Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng sự hấp thụ và tái phát xạ ánh sáng của các chất huỳnh quang để chụp ảnh các cấu trúc được đánh dấu; kính hiển vi đồng tiêu là một kỹ thuật huỳnh quang trong đó một lỗ kim loại loại trừ ánh sáng ngoài tiêu điểm để chỉ một mặt phẳng mỏng trong tiêu điểm đóng góp vào mỗi hình ảnh, tạo ra các lát cắt quang học.

Scope

Mục này bao gồm nguyên lý tương phản huỳnh quang, ưu điểm cắt lát quang học của hình ảnh đồng tiêu và nhóm rộng các phương pháp siêu phân giải giúp đẩy hình ảnh huỳnh quang vượt qua giới hạn nhiễu xạ. Mục này coi đây là các phương pháp hình ảnh trong sinh học tế bào chứ không phải là hướng dẫn lâm sàng.

Core questions

• Huỳnh quang cung cấp độ tương phản phân tử trong tế bào như thế nào?
• Lỗ kim đồng tiêu tạo ra các lát cắt quang học như thế nào?
• Hình ảnh ba chiều của tế bào được tái tạo như thế nào?
• Các phương pháp siêu phân giải vượt qua giới hạn nhiễu xạ như thế nào?

Key concepts

• Kích thích và phát xạ huỳnh quang
• Chất huỳnh quang và protein huỳnh quang
• Lỗ kim đồng tiêu và cắt lát quang học
• Tái tạo ba chiều
• Tẩy trắng quang học và độc tính quang học
• Hình ảnh siêu phân giải (không giới hạn nhiễu xạ)

Mechanisms

Trong kính hiển vi huỳnh quang, một chất huỳnh quang hấp thụ ánh sáng kích thích và tái phát xạ ở bước sóng dài hơn, được tách ra khỏi ánh sáng kích thích bằng các bộ lọc để tạo ra độ tương phản sáng, đặc trưng trên nền tối, như được Lichtman và Conchello đánh giá. Tuy nhiên, một hình ảnh huỳnh quang thông thường chứa ánh sáng mờ từ phía trên và phía dưới mặt phẳng tiêu điểm; kính hiển vi đồng tiêu đặt một lỗ kim loại liên hợp với điểm tiêu điểm để ánh sáng ngoài tiêu điểm bị loại bỏ, tạo ra các lát cắt quang học được Conchello và Lichtman mô tả có thể được xếp chồng lên nhau thành ba chiều. Bởi vì sự phát xạ, giống như tất cả kính hiển vi quang học, vẫn bị giới hạn nhiễu xạ, các phương pháp siêu phân giải như kính hiển vi suy giảm phát xạ kích thích, được Hell và Wichmann giới thiệu, thao tác quá trình huỳnh quang để phân giải chi tiết vượt xa giới hạn đó, như được Schermelleh và các cộng sự khảo sát.

Clinical relevance

Kính hiển vi đồng tiêu và huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong bệnh lý học, nhãn khoa và nghiên cứu y sinh để định vị các phân tử và hình ảnh mô ở ba chiều. Mục này giải thích các nguyên tắc hình ảnh liên quan và mang tính chất giáo dục tham khảo, không phải là cơ sở cho các quyết định chẩn đoán hoặc điều trị cá nhân.

History

Nguyên lý đồng tiêu được Marvin Minsky hình thành vào những năm 1950, nhưng kính hiển vi đồng tiêu quét laser thực tế và các chất huỳnh quang tổng hợp và mã hóa di truyền sáng đã làm cho hình ảnh huỳnh quang trở nên thống trị trong sinh học tế bào từ cuối thế kỷ XX. Việc phá vỡ giới hạn nhiễu xạ sau đó bằng kính hiển vi suy giảm phát xạ kích thích (Hell & Wichmann, 1994) và các kỹ thuật liên quan đã mở ra kỷ nguyên hình ảnh huỳnh quang siêu phân giải được Schermelleh và các cộng sự tóm tắt.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

Lỗ kim đồng tiêu có tác dụng gì?

Nó được định vị sao cho ánh sáng từ bên ngoài mặt phẳng tiêu điểm bị chặn, chỉ để lại ánh sáng trong tiêu điểm để tạo thành hình ảnh; điều này tạo ra một lát cắt quang học mỏng có thể được kết hợp với các lát cắt khác thành một hình ảnh ba chiều.

Làm thế nào kính hiển vi huỳnh quang có thể vượt qua giới hạn nhiễu xạ?

Các phương pháp siêu phân giải như kính hiển vi suy giảm phát xạ kích thích kiểm soát quá trình phát xạ huỳnh quang để có thể phân giải chi tiết tốt hơn nhiều so với giới hạn nhiễu xạ cổ điển.