จลนพลศาสตร์สภาวะคงที่และจลนพลศาสตร์แบบเบิร์สต์

จลนพลศาสตร์สภาวะคงที่อธิบายปฏิกิริยาของเอนไซม์หลังจากที่สารเชิงซ้อนเอนไซม์-ซับสเตรตมีความเข้มข้นคงที่โดยประมาณ ซึ่งเป็นช่วงที่กำหนดค่า Km และ kcat จลนพลศาสตร์ก่อนสภาวะคงที่และจลนพลศาสตร์แบบเบิร์สต์จะตรวจสอบระยะเริ่มต้นชั่วคราว ซึ่งวิธีการผสมอย่างรวดเร็วสามารถแยกแยะขั้นตอนการจับและการเกิดปฏิกิริยาเคมีแต่ละขั้นตอนได้ การเกิดผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์ในระยะนี้มักบ่งชี้ว่าขั้นตอนหลังเหตุการณ์ทางเคมีเป็นขั้นตอนจำกัดอัตรา

Definition

จลนพลศาสตร์สภาวะคงที่วิเคราะห์ปฏิกิริยาของเอนไซม์ภายใต้สมมติฐานว่าความเข้มข้นของสารเชิงซ้อนเอนไซม์-ซับสเตรตมีค่าคงที่โดยประมาณตลอดช่วงเวลาการวัด ในขณะที่จลนพลศาสตร์ก่อนสภาวะคงที่ (ชั่วคราว) จะสังเกตระยะเริ่มต้นก่อนที่จะถึงสภาวะนั้น การเกิดผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์คือการก่อตัวของผลิตภัณฑ์อย่างรวดเร็วในปริมาณสัมพันธ์เริ่มต้น ตามด้วยอัตราสภาวะคงที่ที่ช้าลง ซึ่งบ่งชี้ว่าขั้นตอนที่ตามมาจากการเกิดพันธะเคมีเป็นตัวจำกัดการหมุนเวียน

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมการประมาณค่าสภาวะคงที่และพารามิเตอร์ที่กำหนด เหตุผลของการทดลองก่อนสภาวะคงที่ การตีความจลนพลศาสตร์แบบเบิร์สต์ และเทคนิคการผสมอย่างรวดเร็ว (เช่น stopped-flow และ quenched-flow) ที่ใช้ในการสังเกตระยะชั่วคราว เป็นระเบียบวิธีอ้างอิงมากกว่าคำแนะนำทางคลินิก

Core questions

• สมมติฐานสภาวะคงที่หมายถึงอะไรและใช้ได้เมื่อใด?
• ระยะก่อนสภาวะคงที่ให้ข้อมูลเพิ่มเติมอะไรบ้าง?
• การเกิดผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์บ่งชี้ถึงกลไกอะไร?
• วิธีการผสมอย่างรวดเร็วแบบใดที่สามารถแยกแยะขั้นตอนชั่วคราวได้?

Key concepts

• การประมาณค่าสภาวะคงที่
• ระยะก่อนสภาวะคงที่ (ชั่วคราว)
• ระยะเบิร์สต์และการไทเทรตตำแหน่งเร่งปฏิกิริยา
• การระบุขั้นตอนจำกัดอัตรา
• วิธีการ Stopped-flow และ Quenched-flow
• การทดลองแบบ Single-turnover

Key theories

การประมาณค่าสภาวะคงที่

Briggs และ Haldane สันนิษฐานว่าหลังจากช่วงเวลาชั่วคราวสั้นๆ สารเชิงซ้อนเอนไซม์-ซับสเตรตจะมีความเข้มข้นคงที่โดยประมาณ ซึ่งช่วยให้สามารถหาสมการกฎอัตราทั่วไปและกำหนดค่า Km ในรูปของค่าคงที่อัตราที่เกี่ยวข้องทั้งหมดได้

จลนพลศาสตร์แบบเบิร์สต์

เมื่อการเกิดอะซิลเลชันหรือขั้นตอนทางเคมีเริ่มต้นอื่นๆ เกิดขึ้นอย่างรวดเร็ว แต่ขั้นตอนที่ตามมา เช่น การดีอะซิลเลชัน เกิดขึ้นช้า การหมุนเวียนครั้งแรกจะผลิตผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์ในปริมาณสัมพันธ์อย่างรวดเร็วก่อนที่จะเข้าสู่อัตราสภาวะคงที่ที่ช้าลง ซึ่งช่วยให้สามารถไทเทรตตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาและกำหนดขั้นตอนได้

Mechanisms

หลังจากผสมเอนไซม์และซับสเตรต จะมีช่วงเวลาชั่วคราวสั้นๆ ที่สารเชิงซ้อนเอนไซม์-ซับสเตรตสะสมตัว เมื่อความเข้มข้นของมันเปลี่ยนแปลงช้าเมื่อเทียบกับการเกิดผลิตภัณฑ์ ปฏิกิริยาจะเข้าสู่สภาวะคงที่ซึ่งการวัดอัตราเริ่มต้นแบบดั้งเดิมสามารถนำมาใช้ได้ และกำหนดค่า Km และ kcat การศึกษาช่วงชั่วคราวต้องใช้อุปกรณ์ผสมอย่างรวดเร็วที่สังเกตเหตุการณ์ในระดับมิลลิวินาที โดยการตรวจสอบสัญญาณแสงอย่างต่อเนื่อง (stopped-flow) หรือการหยุดปฏิกิริยาทางเคมีที่เวลาที่กำหนด (quenched-flow) เมื่อขั้นตอนทางเคมีเริ่มต้นเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วเมื่อเทียบกับขั้นตอนที่ตามมา วงจรเร่งปฏิกิริยาแรกจะผลิตผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์ในปริมาณเท่ากับเอนไซม์ที่มีอยู่ หลังจากนั้นขั้นตอนที่ช้ากว่าจะกำหนดอัตราสภาวะคงที่ ดังนั้นขนาดของเบิร์สต์สามารถใช้ในการไทเทรตตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาที่ทำงานได้ และจลนพลศาสตร์ของมันช่วยในการกำหนดว่าขั้นตอนใดเป็นขั้นตอนจำกัดอัตรา การสาธิตแบบคลาสสิกคือพฤติกรรมการเกิดอะซิลเลชัน-ดีอะซิลเลชันของไคโมทริปซิน

Clinical relevance

การแยกแยะพฤติกรรมสภาวะคงที่ออกจากพฤติกรรมชั่วคราวเป็นพื้นฐานในการระบุขั้นตอนจำกัดอัตราของเอนไซม์เมตาบอลิซึมและเอนไซม์ที่ใช้ในการเผาผลาญยา และวิธีการจำแนกลักษณะการยับยั้งแบบโควาเลนต์ ซึ่งเป็นพื้นฐานสำหรับเภสัชวิทยาของเอนไซม์และการออกแบบการทดสอบ หัวข้อนี้อธิบายวิธีการเหล่านี้เป็นข้อมูลอ้างอิงและไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจในการวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

History

Briggs และ Haldane ได้นำเสนอสมมติฐานสภาวะคงที่ในปี 1925 ซึ่งให้กฎอัตราทั่วไปที่เป็นรากฐานของจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์แบบดั้งเดิม การพัฒนาเครื่องมือผสมอย่างรวดเร็วในช่วงกลางศตวรรษที่ 20 ได้เปิดโลกของระบอบก่อนสภาวะคงที่ และการศึกษาของ Hartley และ Kilby ในปี 1952 เกี่ยวกับไคโมทริปซินได้เปิดเผยการปล่อยผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์ซึ่งกลายเป็นกระบวนทัศน์สำหรับการระบุขั้นตอนจำกัดอัตราหลังจากเหตุการณ์ทางเคมี

Key figures

• George Briggs
• J. B. S. Haldane
• Brian Hartley
• Alan Fersht
• Hans Gutfreund

Seminal works

• briggs-haldane-1925
• hartley-kilby-1952

Frequently asked questions

การเกิดผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์บอกอะไรคุณได้บ้าง?

การเกิดผลิตภัณฑ์แบบเบิร์สต์เริ่มต้นอย่างรวดเร็วในปริมาณที่ใกล้เคียงกับความเข้มข้นของเอนไซม์ ตามด้วยอัตราสภาวะคงที่ที่ช้าลง บ่งชี้ว่าขั้นตอนหลังเหตุการณ์ทางเคมีแรก (เช่น การดีอะซิลเลชัน) เป็นขั้นตอนจำกัดอัตรา และขนาดของเบิร์สต์สามารถใช้ในการนับตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาได้

ทำไมต้องศึกษาจลนพลศาสตร์ก่อนสภาวะคงที่ ในเมื่อการวัดสภาวะคงที่ให้ค่า Km และ kcat?

พารามิเตอร์สภาวะคงที่เป็นค่ารวมที่เฉลี่ยตลอดวงจรเร่งปฏิกิริยา การทดลองก่อนสภาวะคงที่สามารถแยกแยะขั้นตอนการจับและการเกิดปฏิกิริยาเคมีแต่ละขั้นตอนได้ ซึ่งเผยให้เห็นค่าคงที่อัตราและสารตัวกลางที่สภาวะคงที่ซ่อนไว้