Metagenomowa i pełnogenomowa identyfikacja patogenów

Metody metagenomiczne i pełnogenomowe wykorzystują wysokoprzepustowe sekwencjonowanie do scharakteryzowania patogenów w skali genomowej. Sekwencjonowanie metagenomiczne odczytuje kwasy nukleinowe bezpośrednio z próbek klinicznych bez ukierunkowania na konkretny organizm, podczas gdy sekwencjonowanie pełnego genomu odczytuje kompletny genom wyizolowanego szczepu, wspierając identyfikację, typowanie i nadzór o wysokiej rozdzielczości.

Definition

Sekwencjonowanie metagenomiczne to nieselektywne sekwencjonowanie wszystkich kwasów nukleinowych w próbce klinicznej w celu wykrycia obecności dowolnego organizmu, podczas gdy sekwencjonowanie pełnego genomu to sekwencjonowanie kompletnego genomu pojedynczego organizmu, zazwyczaj wyizolowanego szczepu, w celu szczegółowej charakterystyki.

Scope

Temat obejmuje niezależne od hodowli sekwencjonowanie nowej generacji (next-generation sequencing, NGS) metagenomiczne w celu bezstronnego wykrywania patogenów oraz sekwencjonowanie pełnego genomu wyizolowanych szczepów w celu identyfikacji, typowania i badania ognisk epidemicznych. Odnosi się również do kwestii analitycznych, interpretacyjnych i kosztowych związanych z tymi metodami. Jest prezentowany jako temat laboratoryjny i referencyjny, bez wskazówek terapeutycznych.

Core questions

• Jakie organizmy są obecne w próbce, gdy przyczyna jest nieznana lub hodowla zawiodła?
• Co kompletny genom wyizolowanego szczepu ujawnia na temat jego tożsamości, typowania i oporności?
• Jak odczyty sekwencjonowania są interpretowane w celu oddzielenia rzeczywistych patogenów od tła i zanieczyszczeń?
• Kiedy korzyści z sekwencjonowania w skali genomowej uzasadniają jego koszt i złożoność?

Key concepts

• Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS)
• Pełnogenomowe sekwencjonowanie (WGS)
• Niezależne od hodowli (nieselektywne) wykrywanie
• Epidemiologia genomiczna
• Interpretacja odczytów, tło i zanieczyszczenia
• Potoki bioinformatyczne i bazy danych referencyjnych
• Efektywność kosztowa metod w skali genomowej

Mechanisms

Sekwencjonowanie metagenomiczne polega na ekstrakcji i sekwencjonowaniu kwasów nukleinowych bezpośrednio z próbki klinicznej, a następnie wykorzystaniu potoków bioinformatycznych do przypisania odczytów do organizmów, co w zasadzie umożliwia wykrywanie bakterii, wirusów, grzybów i pasożytów bez wcześniejszego hipotezy – w tym czynników, które słabo rosną w hodowli, jak w przypadku diagnozy neuroleptospirozy z płynu mózgowo-rdzeniowego (Wilson i in., 2014). Ponieważ próbki zawierają również kwasy nukleinowe gospodarza i środowiska, interpretacja musi odróżniać rzeczywiste patogeny od tła i zanieczyszczeń, co stanowi kluczowe wyzwanie w zastosowaniach klinicznych (Miller & Chiu, 2020). Sekwencjonowanie pełnego genomu zamiast tego odczytuje cały genom wyizolowanego szczepu, zapewniając najwyższą rozdzielczość do identyfikacji, typowania i charakterystyki oporności, a także stanowiąc podstawę epidemiologii genomicznej ognisk epidemicznych (Deng i in., 2016).

Clinical relevance

Sekwencjonowanie w skali genomowej opisuje, w jaki sposób laboratoria mogą wykrywać nieoczekiwane lub niehodowlane patogeny i rekonstruować ogniska epidemiczne z wysoką rozdzielczością, informując diagnozę trudnych przypadków i nadzór nad zapobieganiem infekcjom. Temat wyjaśnia, w jaki sposób generowane są te dowody, i nie stanowi podstawy do indywidualnych decyzji diagnostycznych lub terapeutycznych.

Epidemiology

Pełnogenomowe sekwencjonowanie stało się podstawowym narzędziem epidemiologii genomicznej, umożliwiającym szczegółowy nadzór i badanie ognisk bakteryjnych patogenów, w tym organizmów przenoszonych przez żywność i związanych z opieką zdrowotną (Deng i in., 2016). Oceny ekonomiczne badały, czy taki nadzór jest opłacalny w porównaniu z tradycyjnymi metodami (Price i in., 2023).

Evidence & guidelines

Dowody dotyczące tych metod obejmują kliniczne zastosowania sekwencjonowania metagenomicznego w fazie proof-of-concept (Wilson i in., 2014), krytyczne oceny jego roli klinicznej (Miller & Chiu, 2020), przeglądy nadzoru pełnogenomowego (Deng i in., 2016) oraz przegląd systematyczny jego ocen ekonomicznych (Price i in., 2023). Standardy walidacji i raportowania dla klinicznych testów sekwencjonowania są ustalane przez organizacje zawodowe i regulacyjne i nie są tutaj powielane.

History

Mikrobiologia w skali genomowej nastąpiła po spadku kosztów wysokoprzepustowego sekwencjonowania. Pełnogenomowe sekwencjonowanie wyizolowanych szczepów zostało przyjęte do nadzoru i badania ognisk epidemicznych (Deng i in., 2016), a nieselektywne sekwencjonowanie metagenomiczne wykazało swój potencjał diagnostyczny w przypadkach takich jak identyfikacja niehodowlanego patogenu z płynu mózgowo-rdzeniowego (Wilson i in., 2014), co wywołało trwającą debatę na temat tego, jak i kiedy wdrożyć je klinicznie (Miller & Chiu, 2020).

Debates

Czy sekwencjonowanie metagenomiczne powinno być rutynowo stosowane w laboratorium klinicznym?

Sekwencjonowanie metagenomiczne może wykrywać patogeny, których nie wykrywają inne metody, ale wysoki koszt, złożoność interpretacyjna i trudność w oddzieleniu rzeczywistego sygnału od tła utrzymują jego rutynową rolę kliniczną w sporze.

Czy nadzór pełnogenomowy jest opłacalny?

Pełnogenomowe sekwencjonowanie oferuje lepszą rozdzielczość do nadzoru, ale jego wartość w porównaniu z tańszymi metodami konwencjonalnymi zależy od kontekstu i patogenu, a dowody ekonomiczne są nadal gromadzone.

Seminal works

• wilson-2014
• deng-2016
• miller-2020

Frequently asked questions

Czym różni się sekwencjonowanie metagenomiczne od sekwencjonowania pełnego genomu?

Sekwencjonowanie metagenomiczne odczytuje wszystkie kwasy nukleinowe w próbce w celu wykrycia obecności dowolnego organizmu bez ukierunkowania na jeden, podczas gdy sekwencjonowanie pełnego genomu odczytuje kompletny genom pojedynczego organizmu, zazwyczaj wyizolowanego szczepu, w celu szczegółowej charakterystyki.

Dlaczego interpretacja wyników metagenomicznych jest trudna?

Próbki kliniczne zawierają kwasy nukleinowe gospodarza, środowiska i zanieczyszczeń obok wszelkich patogenów, więc odróżnienie rzeczywistego czynnika sprawczego od tła wymaga starannej interpretacji bioinformatycznej i klinicznej.