分子蛍光分光法

分子蛍光分光法は、分子が放射線を吸収した後に放出する光を測定するものであり、高感度かつ選択的な定量分析を可能にします。

Definition

分子蛍光分光法は、励起電子状態から基底状態に戻る際に分析対象物質が放出する光の強度から、その物質を定量するルミネッセンスベースの分析手法です。

Scope

このトピックでは、分析に用いられる光ルミネッセンス法、主として蛍光、および関連するリン光と化学発光について扱います。励起および発光過程、励起および発光波長選択器が分離された分光蛍光光度計の装置、蛍光強度と量子収率を支配する要因、ならびに定量分析を複雑にするクエンチング効果と内部フィルター効果について論じます。

Core questions

• 吸収と発光はどのように組み合わさって蛍光信号を生成するのか、またなぜそれが非常に高感度なのか？
• どのような分子特性が化合物を強く蛍光性にするのか？
• クエンチング効果と内部フィルター効果は蛍光測定をどのように歪めるのか？
• 微量分析において、蛍光は吸収よりもいつ好ましいのか？

Key theories

ストークスシフトを伴う励起と発光

分子は光子を吸収して励起一重項状態に達し、非放射的にエネルギーを失って最低振動準位に移行した後、より長波長の光子を放出します。このストークスシフトは発光を励起から分離し、蛍光の感度と選択性の基礎となっており、ヤブロンスキー図によって簡潔に示されます。

Mechanisms

紫外または可視光の吸収により、分子は励起一重項状態に昇位します。振動緩和により最低励起準位に到達し、そこからより低いエネルギーの蛍光光子を放出することができます。発光は、大きな透過信号のわずかな変化としてではなく、ほぼ暗い背景に対して測定されるため、蛍光は吸収よりもはるかに低い検出限界に達することができます。強度は低吸光度では濃度に比例しますが、高濃度ではクエンチングおよび内部フィルター吸収によって減少します。

Clinical relevance

蛍光法は、その高い感度と選択的な蛍光標識の利用可能性により、免疫測定法、核酸の定量およびシーケンシング検出、フローサイトメトリー、環境微量分析など、生体分析および臨床診断において中心的な役割を担っています。

History

ジョージ・ストークスは19世紀半ばに蛍光を記述し命名し、特徴的な長波長へのシフトを観察しました。1930年代にヤブロンスキーによって整理されたエネルギー準位図は、競合する放射性および非放射性経路を明確にし、高感度な光電子増倍管ベースの分光蛍光光度計の開発により、蛍光は主要な微量分析技術として確立されました。

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

蛍光は通常、吸収よりも感度が高いのはなぜですか？

蛍光は暗い背景に対して放出される光として測定されるため、かすかな信号でも際立ちます。一方、吸収は大きな透過光束のわずかな減少を検出する必要があるため、測定できる最低濃度が制限されます。

内部フィルター効果とは何ですか？

分析対象物質またはマトリックスの吸光度が高い場合、励起光の一部および放出光の一部が検出器に到達する前に再吸収されるため、蛍光強度は濃度に比例して増加しなくなり、場合によっては減少することもあります。