Fluorescence à molécule unique et FRET

Détecter la lumière d'une seule molécule fluorescente et utiliser le transfert d'énergie entre deux colorants comme une règle nanométrique pour observer les changements conformationnels en temps réel.

Definition

La fluorescence à molécule unique est la détection de l'émission d'un seul fluorophore à la fois ; le FRET est le transfert d'énergie non radiatif entre un colorant donneur et un colorant accepteur, dont l'efficacité dépend fortement de leur séparation.

Scope

Ce sujet couvre la détection de fluorescence au niveau de la molécule unique et le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) comme mesure de distance : la photophysique qui rend possible la détection de molécule unique, la forte dépendance à la distance qui transforme le FRET en une règle sur quelques nanomètres, et ce que le FRET à paire unique révèle sur la dynamique conformationnelle. Les méthodes de molécule unique basées sur la force sont traitées dans des sujets voisins.

Core questions

• Comment est-il possible de détecter la lumière d'une seule molécule fluorescente ?
• Pourquoi l'efficacité du FRET dépend-elle si fortement de la distance donneur-accepteur ?
• Que révèle le FRET à paire unique que le FRET en vrac ne peut pas ?
• Qu'est-ce qui limite la résolution spatiale et temporelle de ces mesures ?

Key theories

Le FRET comme règle nanométrique

L'efficacité du transfert d'énergie diminue avec la puissance six de la séparation donneur-accepteur autour d'une distance de Förster caractéristique, de sorte que l'efficacité mesurée indique des changements de distance de quelques nanomètres avec une grande sensibilité.

Observation de la dynamique par paire unique

Le suivi du FRET entre un seul donneur et un seul accepteur révèle les transitions conformationnelles en temps réel d'une molécule, exposant des états et des cinétiques que le moyennage d'ensemble masque, comme l'ont démontré pour la première fois Ha et ses collègues.

Mechanisms

La détection de molécule unique fonctionne en confinant l'excitation et la collecte à un volume minuscule et en utilisant des détecteurs sensibles afin que les photons d'un fluorophore se distinguent du bruit de fond. Lorsqu'un colorant donneur est excité près d'un accepteur avec des spectres qui se chevauchent, l'énergie est transférée de manière non radiative avec une efficacité déterminée par la dépendance à la distance à la puissance six autour du rayon de Förster ; la mesure de l'émission relative du donneur et de l'accepteur indique donc la séparation. Le suivi de ce signal sur une seule molécule marquée révèle ses états conformationnels et les taux de transition entre eux en temps réel.

Clinical relevance

Ces méthodes révèlent les mécanismes conformationnels des récepteurs, des enzymes et des machines à acides nucléiques qui sont des cibles biomédicales, offrant un aperçu éducatif de la fonction moléculaire plutôt qu'un conseil clinique.

History

La théorie de Förster de 1948 sur le transfert d'énergie par résonance a fourni la dépendance à la distance ; après la première détection optique de molécules uniques, les mesures de FRET à paire unique dans les années 1990 ont transformé ce principe en un outil pour observer les molécules individuelles changer de forme.

Key figures

• Theodor Förster
• Taekjip Ha
• Shimon Weiss
• W. E. Moerner

Seminal works

• ha1996
• forster1948

Frequently asked questions

Pourquoi le FRET est-il appelé une règle moléculaire ?

Parce que l'efficacité du transfert d'énergie entre deux colorants dépend si fortement de leur séparation que le signal mesuré se traduit directement en distances d'environ deux à huit nanomètres.

Qu'apporte l'observation d'une seule molécule par rapport au FRET en vrac ?

Elle montre la séquence réelle des états conformationnels et des transitions d'une molécule, y compris les états transitoires ou rares, plutôt que seulement la moyenne de la population que les mesures en vrac fournissent.