Cryo-microscopie électronique

Imagerie de biomolécules cryoconservées par congélation éclair à l'aide d'électrons et combinaison de nombreuses projections bruitées en une structure tridimensionnelle, sans nécessiter de cristaux.

Definition

La cryo-microscopie électronique est la détermination de la structure biomoléculaire par l'imagerie d'échantillons rapidement congelés à l'aide d'électrons et la reconstruction d'une densité tridimensionnelle à partir de nombreuses images de projection.

Scope

Ce sujet aborde la cryo-microscopie électronique en tant que méthode de détermination de structure : la vitrification de l'échantillon, l'imagerie de particules individuelles avec un microscope électronique à transmission, et la reconstruction computationnelle d'une densité tridimensionnelle à partir de nombreuses projections bidimensionnelles. Il explique pourquoi les détecteurs d'électrons directs ont transformé la résolution atteignable et comment la cryo-ME complète la cristallographie, en particulier pour les assemblages volumineux et flexibles.

Core questions

• Pourquoi l'échantillon est-il congelé rapidement en glace vitreuse ?
• Comment les structures tridimensionnelles sont-elles reconstruites à partir d'images bidimensionnelles ?
• Pourquoi les détecteurs d'électrons directs ont-ils amélioré la résolution de manière si spectaculaire ?
• Pour quels types de molécules la cryo-ME est-elle particulièrement adaptée ?

Key theories

Reconstruction de particules uniques

De nombreuses images bruitées de particules identiques congelées dans des orientations aléatoires sont classées, alignées et combinées pour reconstruire une densité tridimensionnelle, en éliminant par moyennage le bruit qui limite toute image unique à faible dose.

Résolution limitée par le détecteur

Étant donné que les dommages dus aux radiations imposent de faibles doses d'électrons, la qualité d'image a longtemps limité la cryo-ME ; les détecteurs d'électrons directs, dotés d'une haute sensibilité et d'une correction de mouvement image par image, ont levé cette limite et permis une résolution quasi atomique.

Mechanisms

Une fine couche d'échantillon est plongée dans un cryogène si rapidement que l'eau se vitrifie plutôt que de former des cristaux dommageables, préservant ainsi les molécules dans un état quasi-natif. Dans le microscope, les électrons traversent l'échantillon et forment des images de projection, mais pour limiter les dommages dus aux radiations, la dose est maintenue faible, de sorte que chaque image est très bruitée. Un logiciel trie les images de particules, estime l'orientation de chaque particule et combine des milliers à des millions d'entre elles en une densité tridimensionnelle dans laquelle un modèle atomique peut être construit. Les détecteurs directs sensibles qui enregistrent des films et corrigent le mouvement induit par le faisceau ont été essentiels pour atteindre une haute résolution.

Clinical relevance

La cryo-ME fournit désormais des structures de grands complexes et de protéines membranaires qui sont des cibles médicamenteuses majeures, soutenant la recherche basée sur la structure ; la méthode est présentée comme un contexte éducatif, et non comme une orientation clinique.

History

La vitrification de Dubochet, les méthodes de reconstruction de particules uniques de Frank et la quête de résolution atomique de Henderson ont jeté les bases, reconnues par un prix Nobel ; l'arrivée des détecteurs d'électrons directs vers 2013 a produit la révolution de la résolution qui a fait de la cryo-ME une méthode structurale courante.

Key figures

• Richard Henderson
• Joachim Frank
• Jacques Dubochet
• Werner Kühlbrandt

Seminal works

• kuhlbrandt2014
• phillips2012

Frequently asked questions

Pourquoi la cryo-ME n'a-t-elle pas besoin de cristaux ?

Elle image directement de nombreuses particules individuelles et les moyenne de manière computationnelle, évitant ainsi l'étape de cristallisation souvent difficile requise par la cristallographie aux rayons X.

Pourquoi l'échantillon doit-il être maintenu si froid ?

La congélation rapide emprisonne les molécules dans de la glace vitreuse (semblable à du verre) qui préserve leur structure et limite les dommages dus aux radiations pendant l'imagerie, plutôt que de laisser des cristaux de glace ordinaires se former et les déformer.