Cinétique à l'état stationnaire et cinétique de 'burst'

La cinétique à l'état stationnaire décrit les réactions enzymatiques après que le complexe enzyme-substrat a atteint une concentration approximativement constante, le régime dans lequel Km et kcat sont définis. La cinétique pré-état stationnaire et la cinétique de 'burst' examinent la phase transitoire antérieure, où les méthodes de mélange rapide peuvent résoudre les étapes individuelles de liaison et chimiques. Un 'burst' de formation de produit dans cette phase indique souvent qu'une étape postérieure à l'événement chimique est limitante.

Definition

La cinétique à l'état stationnaire analyse les réactions enzymatiques en supposant que la concentration du complexe enzyme-substrat est approximativement constante pendant la période de mesure, tandis que la cinétique pré-état stationnaire (transitoire) observe la phase initiale avant que cet état ne soit atteint ; un 'burst' est une formation initiale rapide et stœchiométrique de produit suivie d'un taux à l'état stationnaire plus lent, indiquant qu'une étape suivant la chimie de liaison limite le turnover.

Scope

Ce sujet couvre l'approximation de l'état stationnaire et les paramètres qu'elle définit, la justification des expériences pré-état stationnaire, l'interprétation de la cinétique de 'burst', et les techniques de mélange rapide (telles que le stopped-flow et le quenched-flow) utilisées pour observer les phases transitoires. Il s'agit d'une méthodologie de référence plutôt que d'une directive clinique.

Core questions

• Qu'implique l'hypothèse de l'état stationnaire et quand est-elle valide ?
• Quelles informations supplémentaires la phase pré-état stationnaire fournit-elle ?
• Qu'indique mécanistiquement un 'burst' de formation de produit ?
• Quelles méthodes de mélange rapide permettent de résoudre les étapes transitoires ?

Key concepts

• Approximation de l'état stationnaire
• Phase pré-état stationnaire (transitoire)
• Phase de 'burst' et titration des sites actifs
• Identification de l'étape limitante
• Méthodes stopped-flow et quenched-flow
• Expériences à turnover unique

Key theories

Steady-state approximation

Briggs et Haldane ont supposé qu'après un bref transitoire, le complexe enzyme-substrat est à une concentration approximativement constante, permettant la dérivation d'une loi de vitesse générale et la définition de Km en termes de toutes les constantes de vitesse pertinentes.

Burst kinetics

Lorsque l'acylation ou une autre étape chimique précoce est rapide mais qu'une étape ultérieure telle que la désacylation est lente, le premier turnover produit un 'burst' stœchiométrique rapide de produit avant de s'établir à un taux à l'état stationnaire plus lent, permettant la titration des sites actifs et l'attribution des étapes.

Mechanisms

Après le mélange de l'enzyme et du substrat, il y a un bref transitoire pendant lequel le complexe enzyme-substrat s'accumule ; une fois que sa concentration change lentement par rapport à la formation du produit, la réaction entre dans l'état stationnaire où les mesures conventionnelles de vitesse initiale s'appliquent et où Km et kcat sont définis. L'étude de la phase transitoire nécessite des instruments de mélange rapide qui observent les événements à l'échelle de la milliseconde, soit en surveillant continuellement un signal optique (stopped-flow), soit en arrêtant chimiquement la réaction à des moments définis (quenched-flow). Lorsqu'une étape chimique précoce est rapide par rapport à une étape ultérieure, le premier cycle catalytique produit un 'burst' de produit d'une quantité égale à l'enzyme présente, après quoi l'étape plus lente détermine le taux à l'état stationnaire ; l'amplitude du 'burst' peut donc être utilisée pour titrer les sites actifs fonctionnels, et sa cinétique aide à déterminer quelle étape est limitante. La démonstration classique est le comportement d'acylation-désacylation de la chymotrypsine.

Clinical relevance

Distinguer le comportement à l'état stationnaire du comportement transitoire est fondamental pour comprendre comment les étapes limitantes des enzymes métaboliques et des enzymes métabolisant les médicaments sont identifiées et comment l'inhibition covalente est caractérisée, ce qui constitue la base de la pharmacologie enzymatique et de la conception des essais. Ce sujet décrit ces méthodes comme un matériel de référence et ne constitue pas une base pour des décisions diagnostiques ou thérapeutiques individuelles.

History

Briggs et Haldane ont introduit l'hypothèse de l'état stationnaire en 1925, fournissant la loi de vitesse générale qui sous-tend la cinétique enzymatique conventionnelle. Le développement de l'instrumentation de mélange rapide au milieu du XXe siècle a ouvert le régime pré-état stationnaire, et l'étude de la chymotrypsine par Hartley et Kilby en 1952 a révélé le 'burst' de libération de produit qui est devenu le paradigme pour l'identification des étapes limitantes après l'événement chimique.

Key figures

• George Briggs
• J. B. S. Haldane
• Brian Hartley
• Alan Fersht
• Hans Gutfreund

Seminal works

• briggs-haldane-1925
• hartley-kilby-1952

Frequently asked questions

Que révèle un 'burst' dans la formation de produit ?

Un 'burst' initial rapide de produit, approximativement égal à la concentration de l'enzyme, suivi d'un taux à l'état stationnaire plus lent, indique qu'une étape postérieure au premier événement chimique (telle que la désacylation) est limitante, et la taille du 'burst' peut être utilisée pour dénombrer les sites actifs.

Pourquoi étudier la cinétique pré-état stationnaire si les mesures à l'état stationnaire donnent Km et kcat ?

Les paramètres à l'état stationnaire sont des composites qui moyennent sur le cycle catalytique ; les expériences pré-état stationnaire résolvent les étapes individuelles de liaison et chimiques, révélant des constantes de vitesse et des intermédiaires que l'état stationnaire masque.