DNA نوترکیب و کلون‌سازی مولکولی

چگونگی استفاده از آنزیم‌های محدودکننده، لیگازها و وکتورها برای برش و اتصال DNA از منابع مختلف و تکثیر آن در سلول‌های میزبان — فناوری بنیادین مهندسی ژنتیک.

Definition

DNA نوترکیب و کلون‌سازی مولکولی مجموعه‌ای از روش‌ها برای اتصال قطعات DNA از منابع مختلف به یک وکتور و تکثیر مولکول حاصل در سلول‌های میزبان است، به طوری که یک توالی DNA انتخابی می‌تواند تکثیر، نگهداری و مطالعه شود.

Scope

این موضوع به ساخت DNA نوترکیب و کلون‌سازی آن می‌پردازد: آنزیم‌های محدودکننده و برش DNA در جایگاه‌های خاص، اتصال قطعات با DNA لیگاز، استفاده از پلاسمید و سایر وکتورها، ورود به سلول‌های میزبان و انتخاب نوترکیب‌ها. این مبحث اصول کلون‌سازی را پوشش می‌دهد؛ تکثیر، توالی‌یابی و ویرایش پایین‌دستی در موضوعات مرتبط دیگر بررسی می‌شوند.

Core questions

• آنزیم‌های محدودکننده چگونه DNA را در توالی‌های خاص برش می‌دهند؟
• قطعات DNA چگونه به یک وکتور متصل می‌شوند؟
• وکتورها چه هستند و چگونه DNA خارجی را به سلول‌های میزبان منتقل می‌کنند؟
• سلول‌های حاوی مولکول نوترکیب مورد نظر چگونه انتخاب می‌شوند؟

Key theories

برش و اتصال توالی‌ویژه

آنزیم‌های محدودکننده توالی‌های DNA تعریف‌شده را شناسایی و برش می‌دهند و اغلب انتهای مکمل را باقی می‌گذارند که DNA لیگاز می‌تواند آن‌ها را به هم متصل کند و امکان نوترکیب شدن قطعات از منابع مختلف را به طور قابل پیش‌بینی فراهم می‌آورد.

تکثیر وکتور-محور

وارد کردن یک قطعه به یک وکتور تکثیرشونده و وارد کردن آن به سلول‌های میزبان، به DNA نوترکیب اجازه می‌دهد تا همراه با میزبان کپی شود و تعداد زیادی کلون یکسان از توالی انتخابی را به دست آورد.

Mechanisms

یک آنزیم محدودکننده هم DNA هدف و هم یک وکتور را در جایگاه‌های شناسایی خاص برش می‌دهد و اغلب انتهای تک‌رشته‌ای مکمل ایجاد می‌کند. قطعات با هم مخلوط شده و توسط DNA لیگاز به هم متصل می‌شوند تا یک مولکول نوترکیب را تشکیل دهند که از طریق ترانسفورماسیون یا روش‌های مرتبط به سلول‌های میزبان وارد می‌شود. از آنجا که وکتور دارای مبدأ همانندسازی و نشانگرهای انتخابی است، سلول‌های میزبانی که DNA نوترکیب را جذب و نگهداری می‌کنند، می‌توانند شناسایی و رشد داده شوند و مقادیر زیادی از توالی کلون‌شده را برای استفاده‌های بعدی تولید کنند.

Clinical relevance

کلون‌سازی مولکولی زیربنای تولید پروتئین‌های نوترکیب مانند انسولین و آنتی‌بادی‌ها و ساخت وکتورها برای ژن‌درمانی و واکسن‌ها است؛ به عنوان اهمیت، نه راهنمایی بالینی، ارائه می‌شود.

History

شناسایی آنزیم‌های محدودکننده توسط آربر، اسمیت و ناتانز، و ساخت اولین مولکول‌های DNA نوترکیب توسط برگ، کوهن و بویر در اوایل دهه ۱۹۷۰، کلون‌سازی مولکولی را پایه‌گذاری کرد و به رسمیت شناختن جایزه نوبل منجر شد و مهندسی ژنتیک را به یک روش معمول تبدیل کرد.

Key figures

• Hamilton Smith
• Daniel Nathans
• Werner Arber
• Paul Berg
• Herbert Boyer
• Stanley Cohen

Seminal works

• smith1970
• watson2013

Frequently asked questions

آنزیم محدودکننده چه کاری انجام می‌دهد؟

این آنزیم یک توالی کوتاه DNA خاص را شناسایی کرده و DNA را در آنجا برش می‌دهد، اغلب انتهای آن را به گونه‌ای باقی می‌گذارد که می‌تواند به قطعات دیگری که توسط همان آنزیم برش خورده‌اند، متصل شود.

چرا وکتورها در کلون‌سازی مورد نیاز هستند؟

یک وکتور DNA وارد شده را به سلول‌های میزبان منتقل می‌کند و در آنجا تکثیر می‌شود، بنابراین توالی کلون‌شده کپی شده و می‌تواند انتخاب و تکثیر شود.