سینتیک حالت پایدار و سینتیک انفجاری

سینتیک حالت پایدار واکنش‌های آنزیمی را پس از رسیدن کمپلکس آنزیم-سوبسترا به غلظت تقریباً ثابت توصیف می‌کند، که رژیمی است که در آن Km و kcat تعریف می‌شوند. سینتیک پیش از حالت پایدار و سینتیک انفجاری فاز گذرا و اولیه را بررسی می‌کنند، جایی که روش‌های اختلاط سریع می‌توانند مراحل اتصال و شیمیایی فردی را تفکیک کنند. انفجار تشکیل محصول در این فاز اغلب نشان‌دهنده این است که مرحله‌ای پس از رویداد شیمیایی، محدودکننده سرعت است.

Definition

سینتیک حالت پایدار واکنش‌های آنزیمی را با فرض اینکه غلظت کمپلکس آنزیم-سوبسترا در طول دوره اندازه‌گیری تقریباً ثابت است، تجزیه و تحلیل می‌کند، در حالی که سینتیک پیش از حالت پایدار (گذرا) فاز اولیه را قبل از رسیدن به آن حالت مشاهده می‌کند؛ انفجار، تشکیل سریع و استوکیومتری اولیه محصول است که به دنبال آن یک نرخ حالت پایدار کندتر می‌آید، که نشان می‌دهد مرحله‌ای پس از شیمی پیوند، چرخه کاتالیزوری را محدود می‌کند.

Scope

این موضوع شامل تقریب حالت پایدار و پارامترهایی که تعریف می‌کند، منطق آزمایش‌های پیش از حالت پایدار، تفسیر سینتیک انفجاری، و تکنیک‌های اختلاط سریع (مانند جریان متوقف شده و جریان خاموش شده) است که برای مشاهده فازهای گذرا استفاده می‌شوند. این یک روش مرجع است تا یک راهنمای بالینی.

Core questions

• فرض حالت پایدار چه معنایی دارد و چه زمانی معتبر است؟
• فاز پیش از حالت پایدار چه اطلاعات اضافی ارائه می‌دهد؟
• انفجار تشکیل محصول از نظر مکانیکی چه چیزی را نشان می‌دهد؟
• کدام روش‌های اختلاط سریع مراحل گذرا را تفکیک می‌کنند؟

Key concepts

• تقریب حالت پایدار
• فاز پیش از حالت پایدار (گذرا)
• فاز انفجاری و تیتراسیون جایگاه فعال
• شناسایی مرحله محدودکننده سرعت
• روش‌های جریان متوقف شده و جریان خاموش شده
• آزمایش‌های تک‌چرخشی

Key theories

تقریب حالت پایدار

بریگز و هالدین فرض کردند که پس از یک فاز گذرا کوتاه، کمپلکس آنزیم-سوبسترا در غلظت تقریباً ثابتی قرار دارد، که امکان استخراج یک قانون سرعت عمومی و تعریف Km بر حسب تمام ثابت‌های سرعت مرتبط را فراهم می‌کند.

سینتیک انفجاری

هنگامی که آسیلاسیون یا یک مرحله شیمیایی اولیه دیگر سریع است اما یک مرحله بعدی مانند دآسیلاسیون کند است، اولین چرخه کاتالیزوری یک انفجار استوکیومتری سریع از محصول را قبل از رسیدن به نرخ حالت پایدار کندتر تولید می‌کند، که امکان تیتراسیون جایگاه فعال و تعیین مرحله را فراهم می‌کند.

Mechanisms

پس از مخلوط کردن آنزیم و سوبسترا، یک فاز گذرا کوتاه وجود دارد که طی آن کمپلکس آنزیم-سوبسترا تجمع می‌یابد؛ هنگامی که غلظت آن نسبت به تشکیل محصول به آرامی تغییر می‌کند، واکنش وارد حالت پایدار می‌شود که در آن اندازه‌گیری‌های سرعت اولیه متداول اعمال می‌شود و Km و kcat تعریف می‌شوند. مطالعه فاز گذرا نیازمند ابزارهای اختلاط سریع است که رویدادها را در مقیاس زمانی میلی‌ثانیه مشاهده می‌کنند، یا با نظارت مداوم یک سیگنال نوری (جریان متوقف شده) یا با خاموش کردن شیمیایی واکنش در زمان‌های مشخص (جریان خاموش شده). هنگامی که یک مرحله شیمیایی اولیه نسبت به مرحله بعدی سریع باشد، اولین چرخه کاتالیزوری یک انفجار محصول به میزان برابر با آنزیم موجود تولید می‌کند، پس از آن مرحله کندتر نرخ حالت پایدار را تعیین می‌کند؛ بنابراین دامنه انفجار می‌تواند برای تیتراسیون جایگاه‌های فعال عملکردی استفاده شود، و سینتیک آن به تعیین اینکه کدام مرحله محدودکننده سرعت است کمک می‌کند. نمایش کلاسیک، رفتار آسیلاسیون-دآسیلاسیون کیموتریپسین است.

Clinical relevance

تمایز حالت پایدار از رفتار گذرا، اساس شناسایی مراحل محدودکننده سرعت آنزیم‌های متابولیک و متابولیزه‌کننده دارو و چگونگی مشخص شدن مهار کووالانسی است، که پیش‌زمینه‌ای برای فارماکولوژی آنزیم و طراحی سنجش است. این موضوع این روش‌ها را به عنوان مطالب مرجع توصیف می‌کند و مبنایی برای تصمیم‌گیری‌های تشخیصی یا درمانی فردی نیست.

History

بریگز و هالدین در سال 1925 فرض حالت پایدار را معرفی کردند و قانون سرعت عمومی را ارائه دادند که مبنای سینتیک آنزیمی متداول است. توسعه ابزارهای اختلاط سریع در اواسط قرن بیستم، رژیم پیش از حالت پایدار را گشود، و مطالعه سال 1952 هارلی و کیلبی بر روی کیموتریپسین، انفجار آزادسازی محصول را آشکار کرد که به الگویی برای شناسایی مراحل محدودکننده سرعت پس از رویداد شیمیایی تبدیل شد.

Key figures

• George Briggs
• J. B. S. Haldane
• Brian Hartley
• Alan Fersht
• Hans Gutfreund

Seminal works

• briggs-haldane-1925
• hartley-kilby-1952

Frequently asked questions

انفجار در تشکیل محصول چه چیزی به ما می‌گوید؟

یک انفجار اولیه سریع از محصول که تقریباً برابر با غلظت آنزیم است، و به دنبال آن یک نرخ حالت پایدار کندتر، نشان می‌دهد که مرحله‌ای پس از اولین رویداد شیمیایی (مانند دآسیلاسیون) محدودکننده سرعت است، و اندازه انفجار می‌تواند برای شمارش جایگاه‌های فعال استفاده شود.

چرا سینتیک پیش از حالت پایدار را مطالعه کنیم اگر اندازه‌گیری‌های حالت پایدار Km و kcat را ارائه می‌دهند؟

پارامترهای حالت پایدار ترکیبی هستند که میانگین‌گیری را در طول چرخه کاتالیزوری انجام می‌دهند؛ آزمایش‌های پیش از حالت پایدار مراحل اتصال و شیمیایی فردی را تفکیک می‌کنند و ثابت‌های سرعت و واسطه‌هایی را آشکار می‌سازند که حالت پایدار پنهان می‌کند.