Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia

La inmunohistoquímica (IHQ) y la inmunofluorescencia utilizan anticuerpos para localizar moléculas específicas dentro de una sección de tejido. Un anticuerpo se une a su antígeno diana in situ y luego se hace visible — mediante una enzima que deposita un producto coloreado (IHQ) o mediante un marcador fluorescente visualizado bajo un microscopio de fluorescencia (inmunofluorescencia) — lo que permite la identificación de tipos celulares y moléculas que las tinciones rutinarias no pueden distinguir.

Definition

La inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia son métodos basados en anticuerpos que localizan antígenos específicos en secciones de tejido mediante la unión de anticuerpos marcados a sus dianas y la detección del marcador unido a través de reacciones de color enzimáticas (inmunohistoquímica) o fluorescencia (inmunofluorescencia).

Scope

Este tema abarca el principio del marcaje basado en anticuerpos, la detección directa e indirecta, los sistemas de amplificación de señal, la recuperación antigénica, y la validación y el control de calidad de estos ensayos. Se trata de una referencia metodológica y no proporciona interpretación clínica ni orientación terapéutica.

Core questions

• ¿Cómo logra un anticuerpo la localización molecular específica en el tejido?
• ¿En qué se diferencian los esquemas de detección directa e indirecta?
• ¿Cómo mejoran la sensibilidad los sistemas de amplificación y la recuperación antigénica?
• ¿Cómo se validan y controlan los ensayos basados en anticuerpos para una interpretación fiable?

Key concepts

• Especificidad de unión antígeno-anticuerpo
• Detección directa vs. indirecta
• Amplificación de señal (p. ej., avidina-biotina, sistemas de polímeros)
• Marcadores cromogénicos vs. fluorescentes
• Recuperación de antígenos (epítopos)
• Controles y validación del ensayo
• Especificidad y reactividad cruzada

Mechanisms

El evento central es la unión específica de un anticuerpo a su antígeno dentro de la sección. En el método directo, el propio anticuerpo primario lleva el marcador; en el método indirecto, un anticuerpo primario sin marcar es detectado por un anticuerpo secundario marcado, lo que amplifica y estandariza la detección. Coons y sus colegas demostraron por primera vez que un anticuerpo marcado con un grupo fluorescente podía localizar su antígeno en el tejido (Coons, 1941), estableciendo así la inmunofluorescencia. La detección basada en enzimas permitió entonces señales cromogénicas permanentes, y la sensibilidad se incrementó mediante sistemas de amplificación como el complejo avidina-biotina-peroxidasa (Hsu et al., 1981) y, posteriormente, la detección basada en polímeros. Dado que la fijación con aldehídos puede enmascarar epítopos mediante el entrecruzamiento, a menudo se utilizan pasos de recuperación antigénica basados en calor o proteasas para restaurar la unión del anticuerpo en tejido fijado en formalina e incluido en parafina (Shi et al., 1991). La interpretación fiable depende de controles positivos y negativos apropiados y de la validación analítica formal de cada ensayo (Fitzgibbons et al., 2014).

Clinical relevance

El marcaje basado en anticuerpos es la base de gran parte del diagnóstico y la investigación modernos basados en tejidos, al identificar el linaje celular y marcadores moleculares específicos. Esta entrada describe los métodos y sus requisitos de calidad conceptualmente; es una orientación de referencia y no una base para decisiones diagnósticas o de tratamiento individuales.

Evidence & guidelines

La guía profesional sobre la validación analítica de los ensayos inmunohistoquímicos ha sido emitida por el College of American Pathologists (Fitzgibbons et al., 2014), y los principios del método se consolidan en referencias estándar de histotecnología (Suvarna et al., 2018). Los métodos de recuperación antigénica y amplificación derivan de estudios primarios fundamentales (Shi et al., 1991; Hsu et al., 1981).

History

La localización basada en anticuerpos comenzó con el método de anticuerpos fluorescentes de Coons y sus colegas en 1941, lo que hizo posible la detección de moléculas específicas en el tejido. Los métodos de marcaje enzimático proporcionaron posteriormente señales visibles permanentes, los sistemas de amplificación como el complejo avidina-biotina-peroxidasa (Hsu et al., 1981) aumentaron la sensibilidad, y la recuperación antigénica inducida por calor (Shi et al., 1991) extendió la inmunotinción fiable a material fijado rutinariamente e incluido en parafina. La estandarización y la guía de validación surgieron a medida que los métodos se volvieron centrales en la práctica diagnóstica (Fitzgibbons et al., 2014).

Key figures

• Albert Coons
• Su-Ming Hsu
• Shan-Rong Shi

Seminal works

• coons-1941
• hsu-1981
• shi-1991

Frequently asked questions

¿Cuál es la diferencia entre inmunohistoquímica e inmunofluorescencia?

Ambas utilizan anticuerpos para localizar antígenos en el tejido; la inmunohistoquímica visualiza el anticuerpo unido mediante una enzima que deposita un producto coloreado visible con microscopía de luz, mientras que la inmunofluorescencia utiliza un marcador fluorescente visualizado bajo un microscopio de fluorescencia.

¿Por qué a menudo es necesaria la recuperación antigénica?

La fijación con formalina entrecruza las proteínas y puede enmascarar los epítopos que reconocen los anticuerpos; los pasos de recuperación antigénica basados en calor o enzimas pueden desenmascarar estos epítopos para que la tinción sea posible en tejido fijado en formalina e incluido en parafina.