Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie trennt nichtflüchtige und thermisch labile Verbindungen, indem eine flüssige mobile Phase unter hohem Druck durch eine Säule mit feiner Packung gepumpt wird.

Definition

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist eine Trenntechnik, bei der eine flüssige mobile Phase unter hohem Druck durch eine Säule mit feinen stationären Phasenpartikeln gepresst wird, wodurch Analyten durch ihre differentielle Wechselwirkung mit den beiden Phasen getrennt werden.

Scope

Dieses Thema behandelt die Flüssigkeitschromatographie in ihrer Hochleistungsform: Pumpen und Gradientensysteme, Säulen, die mit kleinen porösen Partikeln gepackt sind, die wichtigsten Trennmodi – Umkehrphase, Normalphase, Ionenaustausch und Größenausschluss – und Detektoren, einschließlich Ultraviolett-, Diodenarray-, Fluoreszenz- und massenspektrometrischer Detektoren. Es befasst sich mit der Methodenentwicklung, der Rolle der Zusammensetzung der mobilen Phase bei der Selektivität und der Quantifizierung anhand von Peakflächen.

Core questions

• Wie unterscheiden sich Trennmodi wie Umkehrphase und Ionenaustausch in ihrem Retentionsmechanismus?
• Wie steuert die Zusammensetzung der mobilen Phase, einschließlich der Gradientenelution, die Selektivität und die Laufzeit?
• Warum verbessern kleinere stationäre Phasenpartikel die Effizienz und zu welchem Preis?
• Wie werden HPLC-Detektoren hinsichtlich Empfindlichkeit, Selektivität und Identifizierung ausgewählt?

Key theories

Umkehrphasenretention

Im dominanten Umkehrphasenmodus hält eine unpolare stationäre Phase Analyten proportional zu ihrer Hydrophobizität aus einer polaren wässrig-organischen mobilen Phase zurück; eine Erhöhung des organischen Anteils reduziert die Retention, was eine abstimmbare, breit anwendbare Trennung organischer Verbindungen ermöglicht.

Mechanisms

Eine Hochdruckpumpe treibt eine flüssige mobile Phase durch eine Säule, die mit porösen Partikeln gepackt ist, die eine gebundene stationäre Phase tragen. Eine in den Fluss injizierte Probe trennt sich, da jeder Analyt entsprechend seiner Chemie zwischen mobiler und stationärer Phase verteilt wird; das Ändern der Zusammensetzung der mobilen Phase während des Laufs, die Gradientenelution, schärft und beschleunigt die Trennung. Eluierende Analyten passieren einen Detektor, dessen Peakflächen sie anhand von Kalibrierstandards quantifizieren.

Clinical relevance

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist die dominierende Methode für pharmazeutische Analysen und Verunreinigungsprofilierungen, die Messung therapeutischer Medikamente und Metaboliten, die Analyse von Lebensmitteln und Naturprodukten sowie die Charakterisierung von Biomolekülen und ist die führende Front-End-Methode für die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie.

History

Die moderne Flüssigkeitschromatographie entstand in den späten 1960er und 1970er Jahren, als Pumpen, feine Partikelpackungen und empfindliche Detektoren Flüssigkeitstrennungen unter hohem Druck ermöglichten. Umkehrphasensäulen mit gebundenem Siliciumdioxid wurden zum Arbeitspferd, und der spätere Übergang zu Partikeln unter zwei Mikrometern führte zu Ultrahochleistungssystemen mit schnelleren, effizienteren Trennungen.

Key figures

• Lloyd Snyder
• Joseph Jack Kirkland
• Csaba Horváth

Seminal works

• snyder2010
• skoog2017

Frequently asked questions

Was ist die Umkehrphasenchromatographie?

Es ist der gebräuchlichste HPLC-Modus, der eine unpolare stationäre Phase und eine polare mobile Phase verwendet, sodass hydrophobere Analyten länger zurückgehalten werden; er eignet sich für eine sehr breite Palette organischer und bioorganischer Verbindungen.

Wie unterscheidet sich HPLC von der Gaschromatographie?

HPLC verwendet eine flüssige mobile Phase und arbeitet bei nahezu Umgebungstemperaturen, sodass sie nichtflüchtige, polare und thermisch empfindliche Verbindungen verarbeiten kann, die nicht mittels Gaschromatographie analysiert werden können.