Kriyo-Elektron Mikroskobu
Hızlı dondurulmuş biyomoleküllerin elektronlarla görüntülenmesi ve kristal ihtiyacı olmaksızın birçok gürültülü projeksiyonun üç boyutlu bir yapıda birleştirilmesi.
Tanım
Kriyo-elektron mikroskobu, hızlı dondurulmuş numunelerin elektronlarla görüntülenmesi ve birçok projeksiyon görüntüsünden üç boyutlu bir yoğunluğun yeniden yapılandırılması yoluyla biyomoleküler yapının belirlenmesidir.
Kapsam
Bu konu, kriyo-elektron mikroskobunu bir yapı belirleme yöntemi olarak ele almaktadır: numunenin vitrifikasyonu, tek parçacıkların transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülenmesi ve birçok iki boyutlu projeksiyondan üç boyutlu bir yoğunluğun bilgisayar destekli yeniden yapılandırılması. Doğrudan elektron dedektörlerinin elde edilebilir çözünürlüğü neden dönüştürdüğünü ve kriyo-EM'nin özellikle büyük ve esnek yapılar için kristalografiği nasıl tamamladığını açıklamaktadır.
Temel sorular
- Numune neden hızlıca camsı buza dondurulur?
- Üç boyutlu yapılar iki boyutlu görüntülerden nasıl yeniden yapılandırılır?
- Doğrudan elektron dedektörleri çözünürlüğü neden bu kadar dramatik bir şekilde iyileştirdi?
- Kriyo-EM hangi tür moleküller için özellikle uygundur?
Temel kuramlar
- Tek Parçacık Yeniden Yapılandırma
- Rastgele yönelimlerde dondurulmuş özdeş parçacıkların birçok gürültülü görüntüsü sınıflandırılır, hizalanır ve birleştirilerek üç boyutlu bir yoğunluk yeniden yapılandırılır; bu sayede herhangi bir tek düşük dozlu görüntüyü sınırlayan gürültü ortadan kaldırılır.
- Dedektör Sınırlı Çözünürlük
- Radyasyon hasarı düşük elektron dozlarını zorunlu kıldığı için, görüntü kalitesi uzun süre kriyo-EM'yi sınırlamıştır; yüksek hassasiyetli ve kare kare hareket düzeltmeli doğrudan elektron dedektörleri bu sınırı ortadan kaldırmış ve atomik çözünürlüğe yakın bir seviyeye ulaşılmasını sağlamıştır.
Mekanizmalar
İnce bir numune tabakası, suyun zarar verici kristaller oluşturmak yerine vitrifiye olması için o kadar hızlı bir kriyojene daldırılır ki, moleküller neredeyse doğal hallerinde korunur. Mikroskopta elektronlar numuneden geçerek projeksiyon görüntüleri oluşturur, ancak radyasyon hasarını sınırlamak için doz düşük tutulur, bu nedenle her görüntü çok gürültülüdür. Yazılım, parçacık görüntülerini sıralar, her parçacığın yönelimini tahmin eder ve binlerce ila milyonlarcasını atomik bir modelin inşa edilebileceği üç boyutlu bir yoğunlukta birleştirir. Filmleri kaydeden ve ışın kaynaklı hareketi düzelten hassas doğrudan dedektörler, yüksek çözünürlüğe ulaşmada anahtar rol oynamıştır.
Klinik önem
Kriyo-EM, artık büyük komplekslerin ve önemli ilaç hedefleri olan membran proteinlerinin yapılarını sunarak yapı tabanlı araştırmaları desteklemektedir; bu yöntem, klinik rehberlik olarak değil, eğitimsel bir arka plan olarak sunulmaktadır.
Tarihçe
Dubochet'nin vitrifikasyonu, Frank'in tek parçacık yeniden yapılandırma yöntemleri ve Henderson'ın atomik çözünürlük arayışı, Nobel Ödülü ile tanınan temelini atmıştır; 2013 civarında doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı, kriyo-EM'yi ana akım bir yapısal yöntem haline getiren çözünürlük devrimini yaratmıştır.
Öne çıkan isimler
- Richard Henderson
- Joachim Frank
- Jacques Dubochet
- Werner Kühlbrandt
İlgili konular
Temel eserler
- kuhlbrandt2014
- phillips2012
Sıkça sorulan sorular
- Kriyo-EM neden kristal gerektirmez?
- Birçok bireysel parçacığı doğrudan görüntüler ve bunları bilgisayar ortamında ortalamasını alır, böylece X-ışını kristalografisinin gerektirdiği genellikle zorlu kristalizasyon adımından kaçınır.
- Numune neden bu kadar soğuk tutulmalıdır?
- Hızlı dondurma, molekülleri yapılarını koruyan ve görüntüleme sırasında radyasyon hasarını sınırlayan camsı (cam benzeri) buz içinde kilitler; böylece sıradan buz kristallerinin oluşup onları bozmasını engeller.