สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ของโมเลกุล

สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ของโมเลกุลเป็นการวัดแสงที่โมเลกุลปล่อยออกมาหลังจากดูดกลืนรังสี ซึ่งให้การหาปริมาณที่มีความไวสูงและมีความจำเพาะเจาะจง

Definition

สเปกโทรสโกปีฟลูออเรสเซนซ์ของโมเลกุลเป็นวิธีการวิเคราะห์ที่อาศัยลูมิเนสเซนซ์ ซึ่งหาปริมาณสารวิเคราะห์จากความเข้มของแสงที่ปล่อยออกมาเมื่อกลับจากสถานะอิเล็กทรอนิกส์กระตุ้นสู่สถานะพื้น

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมวิธีการโฟโตลูมิเนสเซนซ์ที่ใช้ในการวิเคราะห์—โดยหลักคือฟลูออเรสเซนซ์ พร้อมด้วยฟอสฟอเรสเซนซ์และเคมีลูมิเนสเซนซ์ที่เกี่ยวข้อง โดยจะกล่าวถึงกระบวนการกระตุ้นและการปล่อยแสง เครื่องมือของสเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์พร้อมตัวเลือกความยาวคลื่นกระตุ้นและปล่อยแสงที่แยกจากกัน ปัจจัยที่ควบคุมความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์และผลผลิตควอนตัม รวมถึงผลกระทบของการดับแสง (quenching) และตัวกรองภายใน (inner-filter effects) ที่ทำให้การหาปริมาณซับซ้อนขึ้น

Core questions

• การดูดกลืนและการปล่อยแสงรวมกันเพื่อสร้างสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ได้อย่างไร และเหตุใดจึงมีความไวสูงมาก?
• คุณสมบัติของโมเลกุลใดที่ทำให้สารประกอบเกิดฟลูออเรสเซนซ์ได้ดี?
• ผลกระทบของการดับแสงและตัวกรองภายในบิดเบือนการวัดฟลูออเรสเซนซ์ได้อย่างไร?
• เมื่อใดที่ฟลูออเรสเซนซ์ดีกว่าการดูดกลืนแสงสำหรับการวิเคราะห์ร่องรอย?

Key theories

การกระตุ้นและการปล่อยแสงพร้อมการเลื่อนสโตกส์ (Stokes shift)

โมเลกุลดูดกลืนโฟตอนเพื่อไปสู่สถานะซิงเกล็ตกระตุ้น สูญเสียพลังงานแบบไม่แผ่รังสีไปยังระดับการสั่นสะเทือนที่ต่ำที่สุด จากนั้นปล่อยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นยาวขึ้น การเลื่อนสโตกส์นี้แยกการปล่อยแสงออกจากการกระตุ้น และเป็นพื้นฐานของความไวและความจำเพาะของฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งแสดงให้เห็นอย่างกระชับด้วยแผนภาพยาบลอนสกี (Jablonski diagram)

Mechanisms

การดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลตหรือแสงที่มองเห็นได้จะยกระดับโมเลกุลไปสู่สถานะซิงเกล็ตกระตุ้น การผ่อนคลายแบบสั่นสะเทือนจะนำโมเลกุลไปสู่ระดับกระตุ้นที่ต่ำที่สุด ซึ่งจากนั้นจะสามารถปล่อยโฟตอนฟลูออเรสเซนซ์ที่มีพลังงานต่ำกว่าได้ เนื่องจากการวัดการปล่อยแสงทำได้โดยเทียบกับพื้นหลังที่เกือบมืด แทนที่จะเป็นการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในสัญญาณที่ส่งผ่านขนาดใหญ่ ฟลูออเรสเซนซ์จึงสามารถเข้าถึงขีดจำกัดการตรวจจับที่ต่ำกว่าการดูดกลืนแสงมาก ความเข้มเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นที่การดูดกลืนแสงต่ำ แต่จะลดลงเนื่องจากการดับแสงและการดูดกลืนแสงแบบตัวกรองภายในที่ความเข้มข้นสูงขึ้น

Clinical relevance

วิธีการฟลูออเรสเซนซ์มีความสำคัญต่อการวิเคราะห์ทางชีวภาพและการวินิจฉัยทางคลินิก รวมถึงอิมมูโนแอสเซย์ การหาปริมาณและการตรวจลำดับกรดนิวคลีอิก โฟลว์ไซโตเมทรี และการวิเคราะห์ร่องรอยในสิ่งแวดล้อม เนื่องจากมีความไวสูงและมีฉลากฟลูออเรสเซนต์ที่จำเพาะเจาะจงให้เลือกใช้

History

จอร์จ สโตกส์ ได้อธิบายและตั้งชื่อฟลูออเรสเซนซ์ในช่วงกลางศตวรรษที่ 19 โดยสังเกตการเลื่อนลักษณะเฉพาะไปยังความยาวคลื่นที่ยาวขึ้น ภาพระดับพลังงานที่จัดระเบียบโดยยาบลอนสกี (Jabłoński) ในทศวรรษ 1930 ได้ชี้แจงเส้นทางที่แข่งขันกันระหว่างการแผ่รังสีและไม่แผ่รังสี และการพัฒนาสเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์ที่ใช้โฟโตมัลติพลายเออร์ที่มีความไวสูงได้ทำให้ฟลูออเรสเซนซ์กลายเป็นเทคนิคการวิเคราะห์ร่องรอยชั้นนำ

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

เหตุใดฟลูออเรสเซนซ์จึงมักมีความไวสูงกว่าการดูดกลืนแสง?

ฟลูออเรสเซนซ์วัดได้จากแสงที่ปล่อยออกมาเทียบกับพื้นหลังที่มืด ดังนั้นแม้สัญญาณที่อ่อนมากก็ยังโดดเด่น ในขณะที่การดูดกลืนแสงต้องตรวจจับการลดลงเล็กน้อยในลำแสงที่ส่งผ่านขนาดใหญ่ ซึ่งจำกัดความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถวัดได้

ผลกระทบตัวกรองภายใน (inner-filter effect) คืออะไร?

ที่ความเข้มข้นของสารวิเคราะห์หรือเมทริกซ์ที่สูงขึ้น แสงกระตุ้นบางส่วนและแสงที่ปล่อยออกมาบางส่วนจะถูกดูดกลืนซ้ำก่อนที่จะถึงเครื่องตรวจจับ ดังนั้นความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์จึงไม่เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงตามความเข้มข้นอีกต่อไป และอาจลดลงด้วยซ้ำ