จุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอ (Cryo-Electron Microscopy)

การถ่ายภาพชีวโมเลกุลที่ถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วด้วยอิเล็กตรอน และการนำภาพฉายที่มีสัญญาณรบกวนจำนวนมากมารวมกันเพื่อสร้างโครงสร้างสามมิติ โดยไม่จำเป็นต้องใช้ผลึก

Definition

จุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอคือการกำหนดโครงสร้างชีวโมเลกุลโดยการถ่ายภาพตัวอย่างที่ถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วด้วยอิเล็กตรอน และสร้างโครงสร้างความหนาแน่นสามมิติขึ้นใหม่จากภาพฉายหลายภาพ

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอในฐานะวิธีการกำหนดโครงสร้าง: การทำให้ตัวอย่างเป็นแก้ว (vitrification), การถ่ายภาพอนุภาคเดี่ยวด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน, และการสร้างโครงสร้างความหนาแน่นสามมิติขึ้นใหม่ด้วยคอมพิวเตอร์จากภาพฉายสองมิติหลายภาพ อธิบายว่าเหตุใดเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงจึงเปลี่ยนความละเอียดที่ทำได้ และจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเสริมการศึกษาผลึกวิทยาได้อย่างไร โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับโครงสร้างขนาดใหญ่และโครงสร้างที่ยืดหยุ่นได้

Core questions

• เหตุใดตัวอย่างจึงต้องถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วจนกลายเป็นน้ำแข็งแก้ว?
• โครงสร้างสามมิติถูกสร้างขึ้นใหม่จากภาพสองมิติได้อย่างไร?
• เหตุใดเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงจึงช่วยปรับปรุงความละเอียดได้อย่างมาก?
• จุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเหมาะสำหรับโมเลกุลประเภทใดเป็นพิเศษ?

Key theories

การสร้างโครงสร้างอนุภาคเดี่ยวขึ้นใหม่

ภาพที่มีสัญญาณรบกวนจำนวนมากของอนุภาคที่เหมือนกันซึ่งถูกแช่แข็งในทิศทางสุ่มจะถูกจัดประเภท จัดเรียง และรวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างโครงสร้างความหนาแน่นสามมิติขึ้นใหม่ โดยการเฉลี่ยสัญญาณรบกวนที่จำกัดภาพปริมาณรังสีต่ำแต่ละภาพออกไป

ความละเอียดที่จำกัดโดยเครื่องตรวจจับ

เนื่องจากความเสียหายจากรังสีบังคับให้ใช้ปริมาณอิเล็กตรอนต่ำ คุณภาพของภาพจึงเป็นข้อจำกัดของจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอมานาน เครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงที่มีความไวสูงและการแก้ไขการเคลื่อนไหวแบบเฟรมต่อเฟรมได้ยกเลิกข้อจำกัดนั้นและทำให้สามารถบรรลุความละเอียดใกล้ระดับอะตอมได้

Mechanisms

ตัวอย่างที่เป็นชั้นบางๆ จะถูกจุ่มลงในสารแช่แข็งอย่างรวดเร็วจนน้ำกลายเป็นแก้ว (vitrifies) แทนที่จะเกิดผลึกที่อาจสร้างความเสียหาย ซึ่งช่วยรักษาสภาพโมเลกุลให้อยู่ในสภาวะใกล้เคียงธรรมชาติ ภายในกล้องจุลทรรศน์ อิเล็กตรอนจะผ่านตัวอย่างและสร้างภาพฉาย แต่เพื่อจำกัดความเสียหายจากรังสี ปริมาณรังสีจะถูกควบคุมให้ต่ำ ดังนั้นแต่ละภาพจึงมีสัญญาณรบกวนสูง ซอฟต์แวร์จะจัดเรียงภาพอนุภาค ประเมินทิศทางของแต่ละอนุภาค และรวมภาพหลายพันถึงหลายล้านภาพเข้าด้วยกันเป็นโครงสร้างความหนาแน่นสามมิติ ซึ่งสามารถสร้างแบบจำลองอะตอมขึ้นมาได้ เครื่องตรวจจับโดยตรงที่มีความไวสูงที่สามารถบันทึกภาพเคลื่อนไหวและแก้ไขการเคลื่อนที่ที่เกิดจากลำแสงได้นั้นเป็นกุญแจสำคัญในการบรรลุความละเอียดสูง

Clinical relevance

ปัจจุบันจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอสามารถให้โครงสร้างของสารเชิงซ้อนขนาดใหญ่และโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์ซึ่งเป็นเป้าหมายหลักของยาหลายชนิด ซึ่งสนับสนุนการวิจัยที่อิงโครงสร้าง วิธีการนี้ถูกนำเสนอเพื่อเป็นพื้นฐานความรู้ ไม่ใช่คำแนะนำทางการแพทย์

History

การทำให้เป็นแก้วของ Dubochet, วิธีการสร้างโครงสร้างอนุภาคเดี่ยวของ Frank และการแสวงหาความละเอียดระดับอะตอมของ Henderson ได้วางรากฐาน ซึ่งได้รับการยอมรับจากรางวัลโนเบล การมาถึงของเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนโดยตรงประมาณปี 2013 ได้ก่อให้เกิดการปฏิวัติความละเอียดที่ทำให้จุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอเป็นวิธีการทางโครงสร้างหลัก

Key figures

• Richard Henderson
• Joachim Frank
• Jacques Dubochet
• Werner Kühlbrandt

Seminal works

• kuhlbrandt2014
• phillips2012

Frequently asked questions

เหตุใดจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอจึงไม่จำเป็นต้องใช้ผลึก?

เนื่องจากเป็นการถ่ายภาพอนุภาคแต่ละตัวโดยตรงจำนวนมากและทำการเฉลี่ยด้วยคอมพิวเตอร์ จึงหลีกเลี่ยงขั้นตอนการตกผลึกที่มักจะยากซึ่งจำเป็นสำหรับการศึกษาผลึกด้วยรังสีเอกซ์

เหตุใดตัวอย่างจึงต้องถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิต่ำมาก?

การแช่แข็งอย่างรวดเร็วจะตรึงโมเลกุลไว้ในน้ำแข็งแก้ว (vitreous ice) ซึ่งช่วยรักษาสภาพโครงสร้างและจำกัดความเสียหายจากรังสีระหว่างการถ่ายภาพ แทนที่จะปล่อยให้น้ำแข็งธรรมดาก่อตัวและบิดเบือนโครงสร้าง