Одномолекулярная флуоресценция и FRET

Детектирование света от одной флуоресцентной молекулы и использование переноса энергии между двумя красителями в качестве нанометрового измерителя для наблюдения за конформационными изменениями в реальном времени.

Definition

Одномолекулярная флуоресценция — это детектирование эмиссии от одного флуорофора за раз; FRET — это безызлучательный перенос энергии между донорным и акцепторным красителями, эффективность которого сильно зависит от расстояния между ними.

Scope

Эта тема охватывает детектирование флуоресценции на одномолекулярном уровне и фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) как метод измерения расстояния: фотофизические принципы, делающие возможным одномолекулярное детектирование, сильную зависимость от расстояния, превращающую FRET в измеритель на несколько нанометров, и то, что однопарный FRET выявляет в отношении конформационной динамики. Силовые одномолекулярные методы рассматриваются в смежных темах.

Core questions

• Как возможно детектировать свет от одной флуоресцентной молекулы?
• Почему эффективность FRET так сильно зависит от расстояния между донором и акцептором?
• Что выявляет однопарный FRET, чего не может выявить объемный FRET?
• Что ограничивает пространственное и временное разрешение этих измерений?

Key theories

FRET как нанометровый измеритель

Эффективность переноса энергии падает как шестая степень расстояния между донором и акцептором вокруг характерного расстояния Фёрстера, поэтому измеренная эффективность сообщает об изменениях расстояния в несколько нанометров с высокой чувствительностью.

Однопарное наблюдение динамики

Отслеживание FRET между одним донором и акцептором выявляет конформационные переходы одной молекулы в реальном времени, раскрывая состояния и кинетику, которые скрывает усреднение по ансамблю, как впервые продемонстрировали Ха и коллеги.

Mechanisms

Одномолекулярное детектирование работает за счет ограничения возбуждения и сбора света до крошечного объема и использования чувствительных детекторов, так что фотоны от одного флуорофора выделяются на фоне шума. Когда донорный краситель возбуждается вблизи акцептора с перекрывающимися спектрами, энергия передается безызлучательно с эффективностью, определяемой зависимостью от расстояния в шестой степени вокруг радиуса Фёрстера; измерение относительной эмиссии донора и акцептора, таким образом, сообщает о расстоянии между ними. Отслеживание этого сигнала на одной меченой молекуле выявляет ее конформационные состояния и скорости переходов между ними в реальном времени.

Clinical relevance

Эти методы выявляют конформационные механизмы рецепторов, ферментов и нуклеиново-кислотных машин, являющихся биомедицинскими мишенями, предлагая образовательное понимание молекулярной функции, а не клинические рекомендации.

History

Теория резонансного переноса энергии Фёрстера 1948 года предоставила зависимость от расстояния; после первого оптического детектирования отдельных молекул, измерения FRET одной пары в 1990-х годах превратили этот принцип в инструмент для наблюдения за изменением формы отдельных молекул.

Key figures

• Theodor Förster
• Taekjip Ha
• Shimon Weiss
• W. E. Moerner

Seminal works

• ha1996
• forster1948

Frequently asked questions

Почему FRET называют молекулярной линейкой?

Потому что эффективность переноса энергии между двумя красителями настолько сильно зависит от расстояния между ними, что измеренный сигнал напрямую преобразуется в расстояния примерно от двух до восьми нанометров.

Что дает наблюдение за одной молекулой по сравнению с объемным FRET?

Оно показывает фактическую последовательность конформационных состояний и переходов одной молекулы, включая транзиторные или редкие состояния, а не только среднее значение по популяции, которое дают объемные измерения.