Молекулярная флуоресцентная спектроскопия

Молекулярная флуоресцентная спектроскопия измеряет свет, испускаемый молекулами после поглощения ими излучения, обеспечивая высокочувствительное и селективное количественное определение.

Definition

Молекулярная флуоресцентная спектроскопия — это аналитический метод, основанный на люминесценции, который количественно определяет аналиты по интенсивности света, испускаемого ими при возвращении из возбужденного электронного состояния в основное состояние.

Scope

Эта тема охватывает методы фотолюминесценции, используемые в анализе, — главным образом флуоресценцию, а также связанные с ней фосфоресценцию и хемилюминесценцию. В ней рассматриваются процессы возбуждения и эмиссии, приборное оснащение спектрофлуориметра с его отдельными селекторами длин волн возбуждения и эмиссии, факторы, определяющие интенсивность флуоресценции и квантовый выход, а также эффекты тушения и внутреннего фильтра, которые усложняют количественное определение.

Core questions

• Как поглощение и эмиссия объединяются для создания флуоресцентного сигнала, и почему он так чувствителен?
• Какие молекулярные особенности делают соединение сильно флуоресцентным?
• Как эффекты тушения и внутреннего фильтра искажают флуоресцентные измерения?
• Когда флуоресценция предпочтительнее абсорбции для анализа следовых количеств?

Key theories

Возбуждение и эмиссия со стоксовым сдвигом

Молекула поглощает фотон, переходя в возбужденное синглетное состояние, теряет энергию безызлучательно до низшего колебательного уровня, затем испускает фотон большей длины волны; этот стоксов сдвиг разделяет эмиссию и возбуждение и лежит в основе чувствительности и селективности флуоресценции, компактно изображенной на диаграмме Яблонского.

Mechanisms

Поглощение ультрафиолетового или видимого света переводит молекулу в возбужденное синглетное состояние. Вибрационная релаксация приводит ее к низшему возбужденному уровню, откуда она может испускать флуоресцентный фотон меньшей энергии. Поскольку эмиссия измеряется на почти темном фоне, а не как небольшое изменение в большом проходящем сигнале, флуоресценция может достигать значительно более низких пределов обнаружения, чем абсорбция. Интенсивность пропорциональна концентрации при низкой абсорбции, но снижается из-за тушения и поглощения внутренним фильтром при более высокой концентрации.

Clinical relevance

Флуоресцентные методы занимают центральное место в биоанализе и клинической диагностике, включая иммуноанализы, количественное определение и детекцию секвенирования нуклеиновых кислот, проточную цитометрию и анализ следовых количеств в окружающей среде, благодаря их высокой чувствительности и доступности селективных флуоресцентных меток.

History

Джордж Стокс описал и назвал флуоресценцию в середине XIX века, наблюдая характерный сдвиг в сторону более длинных волн. Картина энергетических уровней, организованная Яблонским в 1930-х годах, прояснила конкурирующие радиационные и безызлучательные пути, а разработка чувствительных спектрофлуориметров на основе фотоумножителей утвердила флуоресценцию как ведущий метод анализа следовых количеств.

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

Почему флуоресценция обычно более чувствительна, чем абсорбция?

Флуоресценция измеряется как испускаемый свет на темном фоне, поэтому даже слабый сигнал выделяется, тогда как абсорбция требует обнаружения небольшого уменьшения в большом проходящем пучке, что ограничивает минимальную измеряемую концентрацию.

Что такое эффект внутреннего фильтра?

При более высокой абсорбции аналита или матрицы часть возбуждающего света и часть испускаемого света реабсорбируются до достижения детектора, поэтому интенсивность флуоресценции перестает линейно расти с концентрацией и может даже падать.