Кинетика стационарного состояния и кинетика «всплеска»

Кинетика стационарного состояния описывает ферментативные реакции после того, как концентрация фермент-субстратного комплекса достигла приблизительно постоянного значения, то есть в режиме, в котором определяются Km и kcat. Кинетика предстационарного состояния и кинетика «всплеска» исследуют более раннюю, переходную фазу, где методы быстрого смешивания позволяют разрешить отдельные стадии связывания и химических превращений. «Всплеск» образования продукта в этой фазе часто сигнализирует о том, что стадия, следующая за химическим событием, является лимитирующей.

Definition

Кинетика стационарного состояния анализирует ферментативные реакции, исходя из предположения, что концентрация фермент-субстратного комплекса приблизительно постоянна в течение периода измерения, тогда как кинетика предстационарного состояния (переходная кинетика) наблюдает начальную фазу до достижения этого состояния; «всплеск» — это начальное быстрое стехиометрическое образование продукта, за которым следует более медленная скорость стационарного состояния, что указывает на то, что стадия, следующая за химическим превращением, ограничивает оборот.

Scope

Тема охватывает приближение стационарного состояния и параметры, которые оно определяет, обоснование экспериментов в предстационарном состоянии, интерпретацию кинетики «всплеска» и методы быстрого смешивания (такие как stopped-flow и quenched-flow), используемые для наблюдения переходных фаз. Это справочная методология, а не клиническое руководство.

Core questions

• Что подразумевает допущение стационарного состояния и когда оно применимо?
• Какую дополнительную информацию предоставляет фаза предстационарного состояния?
• Что механистически означает «всплеск» образования продукта?
• Какие методы быстрого смешивания позволяют разрешить переходные стадии?

Key concepts

• Приближение стационарного состояния
• Предстационарная (переходная) фаза
• Фаза «всплеска» и титрование активных центров
• Идентификация лимитирующей стадии
• Методы stopped-flow и quenched-flow
• Эксперименты с однократным оборотом

Key theories

Приближение стационарного состояния

Бриггс и Холдейн предположили, что после короткого переходного периода концентрация фермент-субстратного комплекса является приблизительно постоянной, что позволяет вывести общий закон скорости и определить Km в терминах всех соответствующих констант скорости.

Кинетика «всплеска»

Когда ацилирование или другая ранняя химическая стадия протекает быстро, но последующая стадия, такая как деацилирование, медленна, первый оборот производит быстрый стехиометрический «всплеск» продукта, прежде чем установится более медленная скорость стационарного состояния, что позволяет проводить титрование активных центров и определять стадии.

Mechanisms

После смешивания фермента и субстрата наступает короткий переходный период, в течение которого накапливается фермент-субстратный комплекс; как только его концентрация начинает изменяться медленно относительно образования продукта, реакция переходит в стационарное состояние, где применимы обычные измерения начальной скорости и определяются Km и kcat. Изучение переходной фазы требует приборов быстрого смешивания, которые позволяют наблюдать события в миллисекундном масштабе, либо путем непрерывного мониторинга оптического сигнала (stopped-flow), либо путем химического гашения реакции в заданные моменты времени (quenched-flow). Когда ранняя химическая стадия протекает быстро относительно последующей, первый каталитический цикл производит «всплеск» продукта, равный по количеству присутствующему ферменту, после чего более медленная стадия устанавливает скорость стационарного состояния; таким образом, амплитуда «всплеска» может быть использована для титрования функциональных активных центров, а ее кинетика помогает определить, какая стадия является лимитирующей. Классической демонстрацией является поведение химотрипсина при ацилировании-деацилировании.

Clinical relevance

Различие между стационарным и переходным поведением лежит в основе того, как определяются лимитирующие стадии метаболических и метаболизирующих лекарства ферментов и как характеризуется ковалентное ингибирование, что является основой фармакологии ферментов и разработки анализов. Тема описывает эти методы как справочный материал и не является основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

History

Бриггс и Холдейн ввели допущение стационарного состояния в 1925 году, предоставив общий закон скорости, который является основой традиционной ферментативной кинетики. Разработка приборов быстрого смешивания в середине двадцатого века открыла режим предстационарного состояния, а исследование химотрипсина Хартли и Килби в 1952 году выявило «всплеск» высвобождения продукта, который стал парадигмой для идентификации лимитирующих стадий после химического события.

Key figures

• George Briggs
• J. B. S. Haldane
• Brian Hartley
• Alan Fersht
• Hans Gutfreund

Seminal works

• briggs-haldane-1925
• hartley-kilby-1952

Frequently asked questions

Что означает «всплеск» в образовании продукта?

Быстрый начальный «всплеск» продукта, примерно равный концентрации фермента, за которым следует более медленная скорость стационарного состояния, указывает на то, что стадия после первого химического события (например, деацилирование) является лимитирующей, а размер «всплеска» может быть использован для подсчета активных центров.

Зачем изучать кинетику предстационарного состояния, если измерения в стационарном состоянии дают Km и kcat?

Параметры стационарного состояния являются составными и усредняются по каталитическому циклу; эксперименты в предстационарном состоянии разрешают отдельные стадии связывания и химических превращений, выявляя константы скорости и промежуточные соединения, которые скрыты в стационарном состоянии.