طیفسنجی فلورسانس مولکولی
طیفسنجی فلورسانس مولکولی، نور گسیلشده توسط مولکولها را پس از جذب تابش اندازهگیری میکند و امکان کمیسازی بسیار حساس و انتخابی را فراهم میآورد.
Definition
طیفسنجی فلورسانس مولکولی یک روش تحلیلی مبتنی بر لومینسانس است که آنالیتها را از شدت نوری که هنگام بازگشت از حالت الکترونی برانگیخته به حالت پایه گسیل میکنند، کمیسازی میکند.
Scope
این موضوع به روشهای فوتولومینسانس مورد استفاده در تحلیل میپردازد—عمدتاً فلورسانس، همراه با فسفرسانس و شیمیلومینسانس مرتبط. این مبحث فرآیند برانگیختگی و گسیل، ابزار طیفسنج فلورسانس با انتخابگرهای طول موج برانگیختگی و گسیل جداگانه، عواملی که شدت فلورسانس و بازده کوانتومی را کنترل میکنند، و اثرات خاموشکنندگی و فیلتر داخلی که کمیسازی را پیچیده میکنند، را پوشش میدهد.
Core questions
- چگونه جذب و گسیل با هم ترکیب میشوند تا یک سیگنال فلورسانس تولید کنند، و چرا این سیگنال تا این حد حساس است؟
- چه ویژگیهای مولکولی یک ترکیب را به شدت فلورسنت میکند؟
- چگونه اثرات خاموشکنندگی و فیلتر داخلی اندازهگیریهای فلورسانس را مخدوش میکنند؟
- چه زمانی فلورسانس برای تحلیل ردیابی بر جذب ارجحیت دارد؟
Key theories
- برانگیختگی و گسیل با تغییر استوکس
- یک مولکول یک فوتون را جذب میکند تا به حالت تکین برانگیخته برسد، انرژی را به صورت غیرتابشی به پایینترین سطح ارتعاشی از دست میدهد، سپس یک فوتون با طول موج بلندتر گسیل میکند؛ این تغییر استوکس، گسیل را از برانگیختگی جدا میکند و زیربنای حساسیت و انتخابپذیری فلورسانس است که به طور فشرده توسط نمودار یابلونسکی به تصویر کشیده شده است.
Mechanisms
جذب نور فرابنفش یا مرئی، یک مولکول را به حالت تکین برانگیخته میرساند. آرامش ارتعاشی آن را به پایینترین سطح برانگیخته میآورد، که از آنجا میتواند یک فوتون فلورسانس با انرژی کمتر گسیل کند. از آنجایی که گسیل در برابر یک پسزمینه تقریباً تاریک اندازهگیری میشود، نه به عنوان یک تغییر کوچک در یک سیگنال عبوری بزرگ، فلورسانس میتواند به حدود تشخیص بسیار پایینتری نسبت به جذب دست یابد. شدت در جذب کم متناسب با غلظت است، اما با خاموشکنندگی و جذب فیلتر داخلی در غلظتهای بالاتر کاهش مییابد.
Clinical relevance
روشهای فلورسانس به دلیل حساسیت بالا و در دسترس بودن برچسبهای فلورسنت انتخابی، در بیوآنالیز و تشخیصهای بالینی، از جمله ایمونوآسهها، کمیسازی و توالییابی اسید نوکلئیک، فلوسیتومتری، و تحلیل ردیابی محیطی، محوری هستند.
History
جورج استوکس در اواسط قرن نوزدهم فلورسانس را توصیف و نامگذاری کرد و تغییر مشخصه به طول موجهای بلندتر را مشاهده نمود. تصویر سطوح انرژی که توسط یابلونسکی در دهه ۱۹۳۰ سازماندهی شد، مسیرهای رقابتی تابشی و غیرتابشی را روشن کرد، و توسعه طیفسنجهای فلورسانس حساس مبتنی بر فوتومولتیپلایر، فلورسانس را به عنوان یک تکنیک پیشرو در تحلیل ردیابی تثبیت کرد.
Key figures
- George Gabriel Stokes
- Aleksander Jabłoński
- Joseph R. Lakowicz
Related topics
Seminal works
- lakowicz2006
- skoog2017
Frequently asked questions
- چرا فلورسانس معمولاً حساستر از جذب است؟
- فلورسانس به عنوان نور گسیلشده در برابر یک پسزمینه تاریک اندازهگیری میشود، بنابراین حتی یک سیگنال ضعیف نیز برجسته میشود، در حالی که جذب نیاز به تشخیص کاهش کوچکی در یک پرتو عبوری بزرگ دارد، که این امر میزان غلظت قابل اندازهگیری را محدود میکند.
- اثر فیلتر داخلی چیست؟
- در جذب بالاتر آنالیت یا ماتریس، مقداری از نور برانگیزاننده و مقداری از نور گسیلشده قبل از رسیدن به آشکارساز دوباره جذب میشوند، بنابراین شدت فلورسانس دیگر به صورت خطی با غلظت افزایش نمییابد و حتی ممکن است کاهش یابد.