میکروسکوپ الکترونی کرایو (Cryo-EM)
تصویربرداری از مولکولهای زیستی منجمد شده سریع با الکترونها و ترکیب بسیاری از تصاویر پر نویز برای ایجاد یک ساختار سهبعدی، بدون نیاز به بلورها.
Definition
میکروسکوپ الکترونی کرایو عبارت است از تعیین ساختار زیستمولکولی با تصویربرداری از نمونههای به سرعت منجمد شده با الکترونها و بازسازی یک چگالی سهبعدی از بسیاری از تصاویر پروجکشن.
Scope
این موضوع میکروسکوپ الکترونی کرایو را به عنوان روشی برای تعیین ساختار پوشش میدهد: انجماد شیشهای نمونه، تصویربرداری از ذرات منفرد با میکروسکوپ الکترونی عبوری، و بازسازی محاسباتی یک چگالی سهبعدی از بسیاری از تصاویر دوبعدی. این بخش توضیح میدهد که چرا آشکارسازهای الکترونی مستقیم وضوح قابل دستیابی را متحول کردند و چگونه Cryo-EM مکمل بلورنگاری است، به ویژه برای مجموعههای بزرگ و انعطافپذیر.
Core questions
- چرا نمونه به سرعت در یخ شیشهای منجمد میشود؟
- چگونه ساختارهای سهبعدی از تصاویر دوبعدی بازسازی میشوند؟
- چرا آشکارسازهای الکترونی مستقیم به طور چشمگیری وضوح را بهبود بخشیدند؟
- Cryo-EM برای چه نوع مولکولهایی به ویژه مناسب است؟
Key theories
- بازسازی تکذرهای
- بسیاری از تصاویر پر نویز از ذرات یکسان که در جهتگیریهای تصادفی منجمد شدهاند، طبقهبندی، تراز و ترکیب میشوند تا یک چگالی سهبعدی بازسازی شود و نویزی که هر تصویر تک دوز پایین را محدود میکند، از بین برود.
- وضوح محدود شده توسط آشکارساز
- از آنجا که آسیب ناشی از تابش، دوزهای پایین الکترون را تحمیل میکند، کیفیت تصویر برای مدت طولانی Cryo-EM را محدود میکرد؛ آشکارسازهای الکترونی مستقیم با حساسیت بالا و تصحیح حرکت فریم به فریم، این محدودیت را برطرف کرده و وضوح نزدیک به اتمی را امکانپذیر ساختند.
Mechanisms
یک لایه نازک از نمونه به قدری سریع در یک کرایوژن غوطهور میشود که آب به جای تشکیل بلورهای آسیبرسان، شیشهای میشود و مولکولها را در حالت تقریباً طبیعی خود حفظ میکند. در میکروسکوپ، الکترونها از نمونه عبور کرده و تصاویر پروجکشن را تشکیل میدهند، اما برای محدود کردن آسیب ناشی از تابش، دوز پایین نگه داشته میشود، بنابراین هر تصویر بسیار پر نویز است. نرمافزار تصاویر ذرات را مرتب میکند، جهتگیری هر ذره را تخمین میزند و هزاران تا میلیونها از آنها را در یک چگالی سهبعدی ترکیب میکند که میتوان یک مدل اتمی را در آن ساخت. آشکارسازهای مستقیم حساس که فیلمها را ضبط میکنند و حرکت ناشی از پرتو را تصحیح میکنند، برای دستیابی به وضوح بالا کلیدی بودند.
Clinical relevance
Cryo-EM اکنون ساختارهای کمپلکسهای بزرگ و پروتئینهای غشایی را که اهداف اصلی دارویی هستند، ارائه میدهد و از تحقیقات مبتنی بر ساختار حمایت میکند؛ این روش به عنوان پیشزمینه آموزشی ارائه میشود، نه راهنمایی بالینی.
History
انجماد شیشهای دوبوچه، روشهای بازسازی تکذرهای فرانک، و پیگیری هندرسون برای وضوح اتمی، زمینه را فراهم کردند که با جایزه نوبل به رسمیت شناخته شد؛ ورود آشکارسازهای الکترونی مستقیم در حدود سال ۲۰۱۳، انقلاب وضوح را ایجاد کرد که Cryo-EM را به یک روش ساختاری اصلی تبدیل کرد.
Key figures
- Richard Henderson
- Joachim Frank
- Jacques Dubochet
- Werner Kühlbrandt
Related topics
Seminal works
- kuhlbrandt2014
- phillips2012
Frequently asked questions
- چرا Cryo-EM به بلورها نیاز ندارد؟
- این روش بسیاری از ذرات منفرد را مستقیماً تصویربرداری کرده و به صورت محاسباتی میانگینگیری میکند، بنابراین از مرحله بلورینگی که اغلب دشوار است و توسط بلورنگاری اشعه ایکس مورد نیاز است، اجتناب میکند.
- چرا نمونه باید اینقدر سرد نگه داشته شود؟
- انجماد سریع مولکولها را در یخ شیشهای (شبیه شیشه) قفل میکند که ساختار آنها را حفظ کرده و آسیب ناشی از تابش را در طول تصویربرداری محدود میکند، به جای اینکه اجازه دهد بلورهای یخ معمولی تشکیل شده و آنها را مخدوش کنند.