Molekulare Fluoreszenzspektroskopie

Die molekulare Fluoreszenzspektroskopie misst das von Molekülen emittierte Licht, nachdem diese Strahlung absorbiert haben, und ermöglicht eine hochsensitive und selektive Quantifizierung.

Definition

Die molekulare Fluoreszenzspektroskopie ist eine lumineszenzbasierte analytische Methode, die Analyten anhand der Intensität des Lichts quantifiziert, das sie beim Übergang von einem angeregten Elektronenzustand in den Grundzustand emittieren.

Scope

Dieses Thema behandelt photolumineszente Methoden, die in der Analyse eingesetzt werden – hauptsächlich Fluoreszenz, mit verwandter Phosphoreszenz und Chemilumineszenz. Es behandelt den Anregungs- und Emissionsprozess, die Instrumentierung eines Spektrofluorometers mit seinen separaten Anregungs- und Emissionswellenlängenselektoren, die Faktoren, die die Fluoreszenzintensität und Quantenausbeute bestimmen, sowie die Quench- und Inner-Filter-Effekte, die die Quantifizierung erschweren.

Core questions

• Wie kombinieren sich Absorption und Emission, um ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen, und warum ist es so empfindlich?
• Welche molekularen Merkmale machen eine Verbindung stark fluoreszierend?
• Wie verzerren Quench- und Inner-Filter-Effekte Fluoreszenzmessungen?
• Wann ist Fluoreszenz der Absorption für die Spurenanalyse vorzuziehen?

Key theories

Anregung und Emission mit Stokes-Verschiebung

Ein Molekül absorbiert ein Photon, um einen angeregten Singulettzustand zu erreichen, verliert nicht-radiativ Energie auf das niedrigste Schwingungsniveau und emittiert dann ein Photon längerer Wellenlänge; diese Stokes-Verschiebung trennt Emission von Anregung und liegt der Empfindlichkeit und Selektivität der Fluoreszenz zugrunde, kompakt dargestellt im Jablonski-Diagramm.

Mechanisms

Die Absorption von ultraviolettem oder sichtbarem Licht hebt ein Molekül in einen angeregten Singulettzustand. Vibrationsrelaxation bringt es auf das niedrigste angeregte Niveau, von dem aus es ein Fluoreszenzphoton geringerer Energie emittieren kann. Da die Emission vor einem nahezu dunklen Hintergrund gemessen wird und nicht als geringfügige Änderung eines großen transmittierten Signals, kann die Fluoreszenz weitaus niedrigere Nachweisgrenzen erreichen als die Absorption. Die Intensität ist bei geringer Absorption proportional zur Konzentration, wird aber durch Quenching und durch Inner-Filter-Absorption bei höherer Konzentration reduziert.

Clinical relevance

Fluoreszenzmethoden sind aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und der Verfügbarkeit selektiver Fluoreszenzmarker von zentraler Bedeutung für die Bioanalyse und klinische Diagnostik, einschließlich Immunoassays, Nukleinsäurequantifizierung und Sequenzierungsdetektion, Durchflusszytometrie und Umweltspurenanalyse.

History

George Stokes beschrieb und benannte die Fluoreszenz Mitte des 19. Jahrhunderts und beobachtete die charakteristische Verschiebung zu längeren Wellenlängen. Das von Jabłoński in den 1930er Jahren organisierte Energieniveaubild klärte die konkurrierenden strahlenden und nicht-strahlenden Wege, und die Entwicklung empfindlicher Photomultiplier-basierter Spektrofluorometer etablierte die Fluoreszenz als eine führende Technik für die Spurenanalyse.

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

Warum ist Fluoreszenz in der Regel empfindlicher als Absorption?

Fluoreszenz wird als Licht gemessen, das vor einem dunklen Hintergrund emittiert wird, sodass selbst ein schwaches Signal auffällt, während Absorption eine geringe Abnahme in einem großen transmittierten Strahl erfassen muss, was die Messung niedriger Konzentrationen begrenzt.

Was ist der Inner-Filter-Effekt?

Bei höherer Analyt- oder Matrixabsorption wird ein Teil des Anregungslichts und ein Teil des emittierten Lichts reabsorbiert, bevor sie den Detektor erreichen, sodass die Fluoreszenzintensität nicht mehr linear mit der Konzentration ansteigt und sogar abfallen kann.