Phổ huỳnh quang phân tử

Phổ huỳnh quang phân tử đo ánh sáng phát ra từ các phân tử sau khi chúng hấp thụ bức xạ, cung cấp khả năng định lượng có độ nhạy và độ chọn lọc cao.

Definition

Phổ huỳnh quang phân tử là một phương pháp phân tích dựa trên sự phát quang, định lượng các chất phân tích từ cường độ ánh sáng mà chúng phát ra khi trở về từ trạng thái điện tử kích thích về trạng thái cơ bản.

Scope

Chủ đề này bao gồm các phương pháp quang phát quang được sử dụng trong phân tích—chủ yếu là huỳnh quang, cùng với lân quang và hóa phát quang liên quan. Nó đề cập đến quá trình kích thích và phát xạ, thiết bị của máy đo phổ huỳnh quang với các bộ chọn bước sóng kích thích và phát xạ riêng biệt, các yếu tố chi phối cường độ huỳnh quang và hiệu suất lượng tử, cũng như các hiệu ứng dập tắt và lọc trong làm phức tạp quá trình định lượng.

Core questions

• Sự hấp thụ và phát xạ kết hợp như thế nào để tạo ra tín hiệu huỳnh quang, và tại sao nó lại nhạy đến vậy?
• Những đặc điểm phân tử nào làm cho một hợp chất phát huỳnh quang mạnh?
• Các hiệu ứng dập tắt và lọc trong làm sai lệch các phép đo huỳnh quang như thế nào?
• Khi nào thì huỳnh quang được ưu tiên hơn hấp thụ để phân tích vết?

Key theories

Kích thích và phát xạ với dịch chuyển Stokes

Một phân tử hấp thụ một photon để đạt đến trạng thái đơn kích thích, mất năng lượng không bức xạ đến mức dao động thấp nhất, sau đó phát ra một photon có bước sóng dài hơn; sự dịch chuyển Stokes này tách biệt sự phát xạ khỏi sự kích thích và là cơ sở cho độ nhạy và độ chọn lọc của huỳnh quang, được mô tả một cách ngắn gọn bằng sơ đồ Jablonski.

Mechanisms

Sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến nâng một phân tử lên trạng thái đơn kích thích. Sự giãn rung đưa nó về mức năng lượng kích thích thấp nhất, từ đó nó có thể phát ra một photon huỳnh quang có năng lượng thấp hơn. Bởi vì sự phát xạ được đo dựa trên một nền gần như tối thay vì một thay đổi nhỏ trong một tín hiệu truyền lớn, huỳnh quang có thể đạt đến giới hạn phát hiện thấp hơn nhiều so với hấp thụ. Cường độ tỷ lệ thuận với nồng độ ở độ hấp thụ thấp nhưng bị giảm do sự dập tắt và do sự hấp thụ lọc trong ở nồng độ cao hơn.

Clinical relevance

Các phương pháp huỳnh quang là trọng tâm của phân tích sinh học và chẩn đoán lâm sàng, bao gồm xét nghiệm miễn dịch, định lượng axit nucleic và phát hiện trình tự, đo tế bào dòng chảy và phân tích vết môi trường, nhờ độ nhạy cao và sự sẵn có của các chất đánh dấu huỳnh quang chọn lọc.

History

George Stokes đã mô tả và đặt tên cho huỳnh quang vào giữa thế kỷ 19, quan sát sự dịch chuyển đặc trưng sang bước sóng dài hơn. Bức tranh mức năng lượng được Jabłoński sắp xếp vào những năm 1930 đã làm rõ các con đường bức xạ và không bức xạ cạnh tranh, và sự phát triển của các máy đo phổ huỳnh quang dựa trên ống nhân quang nhạy đã đưa huỳnh quang trở thành một kỹ thuật phân tích vết hàng đầu.

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

Tại sao huỳnh quang thường nhạy hơn hấp thụ?

Huỳnh quang được đo dưới dạng ánh sáng phát ra trên nền tối, vì vậy ngay cả một tín hiệu mờ nhạt cũng nổi bật, trong khi hấp thụ yêu cầu phát hiện một sự giảm nhỏ trong một chùm tia truyền lớn, điều này giới hạn nồng độ thấp nhất có thể đo được.

Hiệu ứng lọc trong là gì?

Ở độ hấp thụ chất phân tích hoặc nền cao hơn, một phần ánh sáng kích thích và một phần ánh sáng phát ra bị tái hấp thụ trước khi đến bộ dò, do đó cường độ huỳnh quang không còn tăng tuyến tính với nồng độ và thậm chí có thể giảm.