Moleküler Floresans Spektroskopisi
Moleküler floresans spektroskopisi, moleküllerin radyasyonu absorbe ettikten sonra yaydıkları ışığı ölçerek yüksek hassasiyetli ve seçici kantitasyon sağlamaktadır.
Tanım
Moleküler floresans spektroskopisi, analitleri uyarılmış elektronik durumdan temel duruma dönerken yaydıkları ışığın yoğunluğundan nicelendiren, lüminesans tabanlı bir analitik yöntemdir.
Kapsam
Bu konu, analizde kullanılan fotolüminesans yöntemlerini—başlıca floresans ile ilişkili fosforesans ve kemilüminesansı—kapsamaktadır. Uyarma ve emisyon sürecini, ayrı uyarma ve emisyon dalga boyu seçicilerine sahip bir spektroflorometrenin enstrümantasyonunu, floresans yoğunluğunu ve kuantum verimini yöneten faktörleri, ayrıca kantitasyonu zorlaştıran sönümleme (quenching) ve iç filtre (inner-filter) etkilerini ele almaktadır.
Temel sorular
- Absorpsiyon ve emisyon bir floresans sinyali üretmek için nasıl birleşir ve bu neden bu kadar hassastır?
- Bir bileşiği güçlü bir şekilde floresan yapan moleküler özellikler nelerdir?
- Sönümleme (quenching) ve iç filtre (inner-filter) etkileri floresans ölçümlerini nasıl bozmaktadır?
- Eser analiz için floresans, absorpsiyona ne zaman tercih edilmektedir?
Temel kuramlar
- Stokes Kayması ile Uyarma ve Emisyon
- Bir molekül, uyarılmış tekli (singlet) duruma ulaşmak için bir foton absorbe eder, enerjiyi radyatif olmayan yolla en düşük titreşim seviyesine kaybeder ve ardından daha uzun dalga boylu bir foton yayar; bu Stokes kayması, emisyonu uyarılmadan ayırır ve floresansın hassasiyetinin ve seçiciliğinin temelini oluşturur, bu durum Jabłoński diyagramı ile kompakt bir şekilde tasvir edilmektedir.
Mekanizmalar
Ultraviyole veya görünür ışığın absorpsiyonu bir molekülü uyarılmış tekli (singlet) duruma yükseltmektedir. Titreşimsel gevşeme (vibrational relaxation) onu en düşük uyarılmış seviyeye getirmekte ve buradan daha düşük enerjili bir floresans fotonu yayabilmektedir. Emisyon, büyük bir iletilen sinyaldeki küçük bir değişiklik olarak değil, neredeyse karanlık bir arka plana karşı ölçüldüğü için, floresans absorpsiyondan çok daha düşük tespit limitlerine ulaşabilmektedir. Yoğunluk, düşük absorbansda konsantrasyonla orantılıdır ancak yüksek konsantrasyonda sönümleme (quenching) ve iç filtre (inner-filter) absorpsiyonu ile azalmaktadır.
Klinik önem
Floresans yöntemleri, yüksek hassasiyetleri ve seçici floresan etiketlerin (labels) mevcudiyeti nedeniyle immünoassayler, nükleik asit kantitasyonu ve sekanslama tespiti, akış sitometrisi ve çevresel eser analizleri dahil olmak üzere biyoanaliz ve klinik tanıda merkezi bir rol oynamaktadır.
Tarihçe
George Stokes, 19. yüzyılın ortalarında floresansı tanımlamış ve adlandırmış, karakteristik olarak daha uzun dalga boylarına kaymayı gözlemlemiştir. Jabłoński tarafından 1930'larda düzenlenen enerji seviyesi tablosu, rekabet eden radyatif ve radyatif olmayan yolları açıklığa kavuşturmuş ve hassas fotomültiplikatör tabanlı spektroflorometrelerin geliştirilmesi, floresansı önde gelen bir eser analiz tekniği olarak kabul ettirmiştir.
Öne çıkan isimler
- George Gabriel Stokes
- Aleksander Jabłoński
- Joseph R. Lakowicz
İlgili konular
Temel eserler
- lakowicz2006
- skoog2017
Sıkça sorulan sorular
- Floresans neden genellikle absorpsiyondan daha hassastır?
- Floresans, karanlık bir arka plana karşı yayılan ışık olarak ölçülür, bu nedenle zayıf bir sinyal bile belirginleşir; oysa absorpsiyon, büyük bir iletilen ışın demetindeki küçük bir azalmayı tespit etmeyi gerektirir, bu da ölçülebilecek konsantrasyonun alt sınırını kısıtlamaktadır.
- İç filtre (inner-filter) etkisi nedir?
- Daha yüksek analit veya matris absorbansında, uyarıcı ışığın bir kısmı ve yayılan ışığın bir kısmı dedektöre ulaşmadan önce yeniden absorbe edilmektedir, bu nedenle floresans yoğunluğu konsantrasyonla doğrusal olarak artmaz ve hatta düşebilmektedir.