Mikroskopi Konfokal dan Fluoresensi

Mikroskopi fluoresensi menghasilkan citra spesimen dengan mengeksitasi molekul fluoresen dan mengumpulkan cahaya panjang gelombang yang lebih panjang yang dipancarkannya, menghasilkan citra sel dengan kontras tinggi dan spesifik secara molekuler. Mikroskopi konfokal menambahkan lubang jarum (pinhole) yang menolak cahaya di luar fokus, menghasilkan penampang optik yang tajam yang dapat disusun menjadi tampilan tiga dimensi sel.

Definition

Mikroskopi fluoresensi menggunakan penyerapan dan pemancaran kembali cahaya oleh fluorofor untuk mencitrakan struktur yang diberi label; mikroskopi konfokal adalah teknik fluoresensi di mana lubang jarum mengecualikan cahaya di luar fokus sehingga hanya bidang tipis yang terfokus yang berkontribusi pada setiap citra, menghasilkan penampang optik.

Scope

Entri ini mencakup prinsip kontras fluoresensi, keuntungan penampang optik dari pencitraan konfokal, dan kelas luas metode super-resolusi yang mendorong pencitraan fluoresensi di bawah batas difraksi. Ini memperlakukan metode-metode ini sebagai metode pencitraan dalam biologi sel dan bukan sebagai instruksi klinis.

Core questions

• Bagaimana fluoresensi memberikan kontras molekuler dalam sel?
• Bagaimana lubang jarum konfokal menghasilkan penampang optik?
• Bagaimana citra tiga dimensi sel direkonstruksi?
• Bagaimana metode super-resolusi melampaui batas difraksi?

Key concepts

• Eksitasi dan emisi fluoresensi
• Fluorofor dan protein fluoresen
• Lubang jarum konfokal dan penampang optik
• Rekonstruksi tiga dimensi
• Fotopemutihan dan fototoksisitas
• Pencitraan super-resolusi (tanpa batas difraksi)

Mechanisms

Dalam mikroskopi fluoresensi, fluorofor menyerap cahaya eksitasi dan memancarkan kembali pada panjang gelombang yang lebih panjang, yang dipisahkan dari eksitasi oleh filter untuk memberikan kontras cerah dan spesifik terhadap latar belakang gelap, sebagaimana ditinjau oleh Lichtman dan Conchello. Namun, citra fluoresensi konvensional mengandung cahaya buram dari atas dan bawah bidang fokus; mikroskopi konfokal menempatkan lubang jarum yang berkonjugasi dengan titik fokus sehingga cahaya di luar fokus ditolak, menghasilkan penampang optik yang dijelaskan oleh Conchello dan Lichtman yang dapat ditumpuk menjadi tiga dimensi. Karena emisi, seperti semua mikroskopi cahaya, masih tunduk pada batas difraksi, pendekatan super-resolusi seperti mikroskopi stimulasi-emisi-depletion, yang diperkenalkan oleh Hell dan Wichmann, memanipulasi proses fluoresensi itu sendiri untuk menyelesaikan detail jauh di bawah batas tersebut, sebagaimana disurvei oleh Schermelleh dan rekan-rekan.

Clinical relevance

Mikroskopi konfokal dan fluoresensi banyak digunakan dalam patologi, oftalmologi, dan penelitian biomedis untuk melokalisasi molekul dan mencitrakan jaringan dalam tiga dimensi. Entri ini menjelaskan prinsip-prinsip pencitraan yang terlibat dan bersifat referensi-edukasi, bukan dasar untuk keputusan diagnostik atau pengobatan individual.

History

Prinsip konfokal dikemukakan oleh Marvin Minsky pada tahun 1950-an, tetapi mikroskop konfokal pemindaian laser praktis serta fluorofor sintetis dan berkode genetik yang cerah membuat pencitraan fluoresensi dominan dalam biologi sel sejak akhir abad kedua puluh. Pemecahan batas difraksi selanjutnya oleh mikroskopi stimulasi-emisi-depletion (Hell & Wichmann, 1994) dan teknik terkait membuka era pencitraan fluoresensi super-resolusi yang dirangkum oleh Schermelleh dan rekan-rekan.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

Apa fungsi lubang jarum konfokal?

Lubang jarum ini diposisikan sedemikian rupa sehingga cahaya dari luar bidang fokus diblokir, hanya menyisakan cahaya yang terfokus untuk membentuk citra; ini menghasilkan penampang optik tipis yang dapat digabungkan dengan yang lain menjadi tampilan tiga dimensi.

Bagaimana mikroskopi fluoresensi dapat melampaui batas difraksi?

Metode super-resolusi seperti mikroskopi stimulasi-emisi-depletion mengontrol proses emisi fluoresensi sehingga detail jauh di bawah batas difraksi klasik dapat diselesaikan.