Espectroscopia de Fluorescencia Molecular

La espectroscopia de fluorescencia molecular mide la luz emitida por las moléculas después de que absorben radiación, proporcionando una cuantificación altamente sensible y selectiva.

Definition

La espectroscopia de fluorescencia molecular es un método analítico basado en la luminiscencia que cuantifica los analitos a partir de la intensidad de la luz que emiten al regresar de un estado electrónico excitado al estado fundamental.

Scope

Este tema abarca los métodos de fotoluminiscencia utilizados en el análisis —principalmente la fluorescencia, con la fosforescencia y la quimioluminiscencia relacionadas. Trata el proceso de excitación y emisión, la instrumentación de un espectrofluorómetro con sus selectores de longitud de onda de excitación y emisión separados, los factores que rigen la intensidad de la fluorescencia y el rendimiento cuántico, y los efectos de extinción y de filtro interno que complican la cuantificación.

Core questions

• ¿Cómo se combinan la absorción y la emisión para producir una señal de fluorescencia, y por qué es tan sensible?
• ¿Qué características moleculares hacen que un compuesto sea fuertemente fluorescente?
• ¿Cómo distorsionan las mediciones de fluorescencia los efectos de extinción y de filtro interno?
• ¿Cuándo es preferible la fluorescencia a la absorción para el análisis de trazas?

Key theories

Excitación y emisión con desplazamiento de Stokes

Una molécula absorbe un fotón para alcanzar un estado singlete excitado, pierde energía de forma no radiativa al nivel vibracional más bajo, y luego emite un fotón de mayor longitud de onda; este desplazamiento de Stokes separa la emisión de la excitación y es la base de la sensibilidad y selectividad de la fluorescencia, representado de forma compacta por el diagrama de Jablonski.

Mechanisms

La absorción de luz ultravioleta o visible eleva una molécula a un estado singlete excitado. La relajación vibracional la lleva al nivel excitado más bajo, desde el cual puede emitir un fotón de fluorescencia de menor energía. Debido a que la emisión se mide contra un fondo casi oscuro en lugar de como un pequeño cambio en una gran señal transmitida, la fluorescencia puede alcanzar límites de detección mucho más bajos que la absorción. La intensidad es proporcional a la concentración a baja absorbancia, pero se reduce por la extinción y por la absorción de filtro interno a mayor concentración.

Clinical relevance

Los métodos de fluorescencia son fundamentales para el bioanálisis y el diagnóstico clínico, incluyendo inmunoensayos, cuantificación de ácidos nucleicos y detección de secuenciación, citometría de flujo y análisis de trazas ambientales, debido a su alta sensibilidad y la disponibilidad de etiquetas fluorescentes selectivas.

History

George Stokes describió y nombró la fluorescencia a mediados del siglo XIX, observando el característico desplazamiento a longitudes de onda más largas. La imagen de los niveles de energía organizada por Jabłoński en la década de 1930 aclaró las vías radiativas y no radiativas en competencia, y el desarrollo de espectrofluorómetros sensibles basados en fotomultiplicadores estableció la fluorescencia como una técnica líder en el análisis de trazas.

Key figures

• George Gabriel Stokes
• Aleksander Jabłoński
• Joseph R. Lakowicz

Seminal works

• lakowicz2006
• skoog2017

Frequently asked questions

¿Por qué la fluorescencia suele ser más sensible que la absorción?

La fluorescencia se mide como luz emitida contra un fondo oscuro, por lo que incluso una señal débil destaca, mientras que la absorción requiere detectar una pequeña disminución en un haz transmitido grande, lo que limita la concentración mínima que se puede medir.

¿Qué es el efecto de filtro interno?

A mayor absorbancia del analito o de la matriz, parte de la luz excitante y parte de la luz emitida se reabsorben antes de llegar al detector, por lo que la intensidad de la fluorescencia ya no aumenta linealmente con la concentración e incluso puede disminuir.