Microscopía Crio-Electrónica

Obtención de imágenes de biomoléculas ultracongeladas con electrones y combinación de muchas proyecciones ruidosas en una estructura tridimensional, sin necesidad de cristales.

Definition

La microscopía crio-electrónica es la determinación de la estructura biomolecular mediante la obtención de imágenes de especímenes rápidamente congelados con electrones y la reconstrucción de una densidad tridimensional a partir de muchas imágenes de proyección.

Scope

Este tema abarca la microscopía crio-electrónica como método de determinación de estructuras: la vitrificación de la muestra, la obtención de imágenes de partículas individuales con un microscopio electrónico de transmisión y la reconstrucción computacional de una densidad tridimensional a partir de muchas proyecciones bidimensionales. Explica por qué los detectores de electrones directos transformaron la resolución alcanzable y cómo la crio-ME complementa la cristalografía, particularmente para ensamblajes grandes y flexibles.

Core questions

• ¿Por qué se congela la muestra rápidamente en hielo vítreo?
• ¿Cómo se reconstruyen las estructuras tridimensionales a partir de imágenes bidimensionales?
• ¿Por qué los detectores de electrones directos mejoraron tan drásticamente la resolución?
• ¿Para qué tipo de moléculas es especialmente adecuada la crio-ME?

Key theories

Reconstrucción de partícula única

Muchas imágenes ruidosas de partículas idénticas congeladas en orientaciones aleatorias se clasifican, alinean y combinan para reconstruir una densidad tridimensional, promediando el ruido que limita cualquier imagen única de baja dosis.

Resolución limitada por el detector

Debido a que el daño por radiación fuerza dosis bajas de electrones, la calidad de la imagen limitó durante mucho tiempo la crio-ME; los detectores de electrones directos con alta sensibilidad y corrección de movimiento cuadro por cuadro eliminaron ese límite y permitieron una resolución casi atómica.

Mechanisms

Una fina capa de muestra se sumerge en un criógeno tan rápido que el agua se vitrifica en lugar de formar cristales dañinos, preservando las moléculas en un estado casi nativo. En el microscopio, los electrones pasan a través del espécimen y forman imágenes de proyección, pero para limitar el daño por radiación, la dosis se mantiene baja, por lo que cada imagen es muy ruidosa. El software clasifica las imágenes de las partículas, estima la orientación de cada partícula y combina miles o millones de ellas en una densidad tridimensional en la que se puede construir un modelo atómico. Los detectores directos sensibles que graban películas y corrigen el movimiento inducido por el haz fueron clave para alcanzar una alta resolución.

Clinical relevance

La crio-ME ahora proporciona estructuras de grandes complejos y proteínas de membrana que son importantes dianas farmacológicas, apoyando la investigación basada en la estructura; el método se presenta como información educativa, no como guía clínica.

History

La vitrificación de Dubochet, los métodos de reconstrucción de partículas individuales de Frank y la búsqueda de resolución atómica de Henderson sentaron las bases, reconocidas con un Premio Nobel; la llegada de los detectores de electrones directos alrededor de 2013 produjo la revolución de la resolución que convirtió a la crio-ME en un método estructural principal.

Key figures

• Richard Henderson
• Joachim Frank
• Jacques Dubochet
• Werner Kühlbrandt

Seminal works

• kuhlbrandt2014
• phillips2012

Frequently asked questions

¿Por qué la crio-ME no necesita cristales?

Obtiene imágenes de muchas partículas individuales directamente y las promedia computacionalmente, por lo que evita el paso de cristalización, a menudo difícil, requerido por la cristalografía de rayos X.

¿Por qué la muestra debe mantenerse tan fría?

La congelación rápida encierra las moléculas en hielo vítreo (similar al vidrio) que preserva su estructura y limita el daño por radiación durante la obtención de imágenes, en lugar de permitir que se formen y distorsionen los cristales de hielo ordinarios.