Μοριακή Διάγνωση Μυκήτων και Παρασίτων

Η μοριακή διάγνωση μυκήτων και παρασίτων εφαρμόζει μεθόδους βασισμένες στα νουκλεϊκά οξέα για την ανίχνευση και αναγνώριση μυκήτων και παρασίτων που συχνά αναπτύσσονται αργά, είναι δύσκολο να καλλιεργηθούν ή αναγνωρίζονται δύσκολα με μικροσκοπία. Οι δείκτες αλληλουχίας και οι δοκιμές ενίσχυσης επεκτείνουν τη διαγνωστική εμβέλεια όπου οι συμβατικές μέθοδοι είναι περιορισμένες.

Definition

Η μοριακή διάγνωση μυκήτων και παρασίτων είναι η χρήση μοριακών μεθόδων — ενίσχυση, υβριδοποίηση και αλληλούχιση περιοχών δεικτών — για την ανίχνευση και αναγνώριση μυκήτων και παρασίτων σε κλινικά δείγματα ή απομονώσεις.

Scope

Το θέμα καλύπτει την κωδικοποίηση DNA μυκήτων (ιδιαίτερα την περιοχή του εσωτερικού μεταγενομένου διαστηματος μεταγραφής), την ανίχνευση μυκητιασικών και παρασιτικών παθογόνων με βάση την PCR, και τα πλεονεκτήματα και τους περιορισμούς αυτών των μεθόδων σε σχέση με την καλλιέργεια και τη μικροσκοπία. Πλαισιώνεται ως εργαστηριακό και θέμα αναφοράς χωρίς οδηγίες θεραπείας ή δοσολογίας.

Core questions

• Ποιος μυκητιασικός ή παρασιτικός οργανισμός είναι παρών, και ποια περιοχή δείκτη τον αναγνωρίζει καλύτερα;
• Πώς συγκρίνονται οι μοριακές μέθοδοι με τη μικροσκοπία και την καλλιέργεια σε ευαισθησία και ειδικότητα;
• Πότε οι μοριακές δοκιμές ανεξάρτητες από την καλλιέργεια προσθέτουν διαγνωστική αξία;

Key concepts

• Περιοχή ITS ως δείκτης μπαρ κωδικοποίησης μυκήτων
• Ανίχνευση παθογόνων με βάση την PCR
• Προβιοτικοί DNA
• Πολυπαραγοντικά μοριακά πάνελ
• Διάγνωση ανεξάρτητη από την καλλιέργεια
• Επιλογή δεικτών και βάσεις δεδομένων αναφοράς

Mechanisms

Για τους μύκητες, η περιοχή του εσωτερικού μεταγενομένου διαστηματος μεταγραφής (ITS) του πυρηνικού ριβοσωμικού RNA λειτουργεί ως ένας ευρέως υιοθετημένος καθολικός δείκτης μπαρ κωδικοποίησης που, όταν αλληλουχείται και αντιστοιχίζεται με βάσεις δεδομένων αναφοράς, αναγνωρίζει τους περισσότερους μύκητες σε επίπεδο γένους ή είδους (Schoch et al., 2012). Οι δοκιμές ενίσχυσης με PCR ενισχύουν ειδικούς στόχους του οργανισμού για την άμεση ανίχνευση μυκήτων σε κλινικό υλικό, κάτι που μπορεί να είναι πολύτιμο για διεισδυτικές ασθένειες όπου η καλλιέργεια είναι αργή ή μη ευαίσθητη, αν και η κλινική τους ετοιμότητα ποικίλλει ανάλογα με το περιβάλλον (Nguyen & Clancy, 2018). Για τα παράσιτα, οι προβιοτικοί DNA και η PCR καθιερώθηκαν νωρίς ως πιο ευαίσθητες εναλλακτικές λύσεις σε ορισμένες συμβατικές μεθόδους (Weiss, 1995), και οι δοκιμές με PCR και οι πολυπαραγοντικές δοκιμές εφαρμόζονται πλέον για την ανίχνευση και διαφοροποίηση εντερικών και άλλων παρασίτων στο κλινικό εργαστήριο (Verweij & Stensvold, 2014).

Clinical relevance

Οι μοριακές διαγνώσεις μυκήτων και παρασίτων περιγράφουν πώς τα εργαστήρια ανιχνεύουν και αναγνωρίζουν οργανισμούς που η καλλιέργεια και η μικροσκοπία μπορεί να παραλείψουν, ενημερώνοντας την διαγνωστική αναφορά και την επιτήρηση. Το θέμα εξηγεί πώς παράγονται αυτά τα στοιχεία και δεν αποτελεί βάση για ατομικές διαγνωστικές ή θεραπευτικές αποφάσεις.

Epidemiology

Η μοριακή ανίχνευση έχει βελτιώσει την αναγνώριση και διαφοροποίηση μυκητιασικών και παρασιτικών λοιμώξεων, ιδιαίτερα για οργανισμούς που είναι δύσκολο να καλλιεργηθούν ή να διακριθούν μορφολογικά, υποστηρίζοντας μια πιο ακριβή αξιολόγηση της εμφάνισής τους σε επίπεδο πληθυσμού (Verweij & Stensvold, 2014; Weiss, 1995).

Evidence & guidelines

Η αναγνώριση μυκήτων με βάση δείκτες βασίζεται στην εργασία κοινοπραξίας που καθιέρωσε την περιοχή ITS ως καθολικό δείκτη μπαρ κωδικοποίησης (Schoch et al., 2012), ενώ ανασκοπήσεις συνοψίζουν την κλινική απόδοση και τους περιορισμούς των δοκιμών PCR για μύκητες και παράσιτα (Nguyen & Clancy, 2018; Verweij & Stensvold, 2014). Τα πρότυπα ανά δοκιμή τίθενται από επαγγελματικούς φορείς και κατασκευαστές και δεν αναπαράγονται εδώ.

History

Οι μοριακές μέθοδοι εισήλθαν στη μυκολογία και την παρασιτολογία καθώς η ανίχνευση με PCR και προβιοτικούς έδειξε μεγαλύτερη ευαισθησία από ορισμένες παραδοσιακές τεχνικές (Weiss, 1995). Η επίσημη υιοθέτηση της περιοχής ITS ως καθολικού δείκτη μπαρ κωδικοποίησης μυκήτων τυποποίησε τη μοριακή αναγνώριση μυκήτων (Schoch et al., 2012), και οι δοκιμές PCR στην παρασιτολογία σταδιακά ενσωματώθηκαν στα τακτικά κλινικά εργαστήρια (Verweij & Stensvold, 2014).

Debates

Είναι οι μοριακές δοκιμές μυκήτων έτοιμες να αντικαταστήσουν την συμβατική διάγνωση;

Οι δοκιμές PCR για μύκητες μπορούν να προσθέσουν ευαισθησία και ταχύτητα για διεισδυτικές ασθένειες, αλλά η μεταβλητότητα στην τυποποίηση και την κλινική επικύρωση σημαίνει ότι συχνά χρησιμοποιούνται για να συμπληρώσουν παρά να αντικαταστήσουν την καλλιέργεια και τον έλεγχο αντιγόνων.

Seminal works

• schoch-2012
• weiss-1995
• verweij-2014

Frequently asked questions

Γιατί χρησιμοποιείται η περιοχή ITS για την αναγνώριση μυκήτων;

Η περιοχή του εσωτερικού μεταγενομένου διαστηματος μεταγραφής συνδυάζει επαρκή συντήρηση για να ενισχυθεί σε όλους τους μύκητες με επαρκή μεταβλητότητα για να διακρίνει πολλά είδη, γεγονός που οδήγησε στην υιοθέτησή της ως καθολικού δείκτη μπαρ κωδικοποίησης DNA μυκήτων.

Αντικαθιστούν οι μοριακές μέθοδοι τη μικροσκοπία και την καλλιέργεια για τα παράσιτα;

Οι μοριακές μέθοδοι συχνά προσθέτουν ευαισθησία και την ικανότητα διαφοροποίησης ειδών, αλλά χρησιμοποιούνται συνήθως παράλληλα με τη μικροσκοπία και άλλες μεθόδους αντί για πλήρη αντικατάσταση, ανάλογα με τον οργανισμό και το κλινικό πλαίσιο.